Patch Clamp Automatizado: Avances en Neurociencia

La técnica de patch clamp es fundamental en neurociencia para registrar la actividad eléctrica de células individuales, especialmente neuronas. Tradicionalmente, ha sido un proceso laborioso que requiere gran habilidad manual y consume mucho tiempo, limitando el número de células que pueden estudiarse de manera eficiente. Para superar estas limitaciones y estandarizar su uso, se han desarrollado importantes esfuerzos para automatizar los pasos secuenciales de esta técnica, tanto para preparaciones in vitro como in vivo.

Los sistemas automatizados disponibles actualmente han demostrado varios niveles de éxito al reproducir o incluso superar la calidad, el rendimiento y la velocidad de las grabaciones realizadas por experimentadores humanos.

Grabaciones Automatizadas de Patch Clamp In Vitro

Los primeros intentos de automatizar la técnica de patch clamp llevaron al desarrollo de dispositivos planares para grabaciones in vitro a partir de células cultivadas. En lugar del enfoque tradicional 'de arriba hacia abajo' utilizado en las grabaciones manuales para el contacto entre la pipeta y la célula objetivo, estos sistemas automatizados utilizan una configuración 'de abajo hacia arriba'. En esta configuración, cada pozo de una placa de múltiples pozos tiene una pequeña abertura en la superficie inferior. Después de introducir las células objetivo en suspensión en los pozos, se aplica una presión negativa a través de las aberturas para acercar las células y formar posteriormente un gigaseal (un sello de alta resistencia entre la pipeta y la membrana celular).

Aunque estos sistemas permiten grabaciones automatizadas de Patch Clamp con un rendimiento mucho mayor en comparación con el enfoque manual, la configuración planar limita su uso a células que pueden ser aisladas y suspendidas en una solución.

También se han desarrollado sistemas automatizados que utilizan electrodos de patch convencionales y preparaciones de muestras. Por ejemplo, el sistema de patch-clamp multi-electrodo desarrollado por Perin y Markram (2013) se basa en un equipo de patch convencional y simplifica el patch multi-célula en cortes de cerebro al automatizar el posicionamiento de las pipetas de patch cerca de las células objetivo. El sistema también proporciona un sistema neumático controlado por una interfaz humana para ajustes de presión de la pipeta repetibles y precisos durante el patching. Sin embargo, varios pasos clave aún quedan a cargo de los experimentadores humanos (por ejemplo, el acercamiento final para contactar la célula con la punta de la pipeta; la activación de los ajustes de nivel de presión para el sellado y la ruptura).

Con este sistema, se pudieron registrar simultáneamente doce neuronas en cortes cerebrales de ratas, superando con creces el número de células que se pueden registrar simultáneamente utilizando un enfoque completamente manual.

Para permitir una automatización casi completa de las grabaciones de patch clamp guiadas por imágenes en cortes cerebrales, un sistema reciente denominado "Autopatcher IG" ("Image-Guided"; Wu et al., 2016) utiliza algoritmos basados en visión por computadora para la calibración automática de la punta de la pipeta y la detección de células fluorescentes. La calibración de la punta de la pipeta implica la detección automática de la ubicación de la punta de la pipeta que se imagen utilizando un microscopio vertical basado en DIC sin fluorescencia.

Dado que las estrategias comunes de reconocimiento de objetos y formas basadas en fluorescencia (por ejemplo, umbralización basada en intensidad de fluorescencia seguida de detección de forma o borde) no pueden detectar de manera fiable las puntas de pipeta no fluorescentes, el Autopatcher IG aborda el desafío de localizar la posición de la punta de la pipeta implementando un algoritmo de procesamiento de imágenes de múltiples etapas que involucra reducción de ruido, detección de bordes, extracción de características e inversión de color. Esta estrategia de detección de la punta de la pipeta mantuvo el error de posicionamiento bajo (1.6 μm en promedio) durante la calibración automática de la punta de la pipeta, lo que posteriormente permitió la navegación automatizada de la pipeta a una célula objetivo. El Autopatcher IG también automatiza la formación del sello y la ruptura, proporcionando una plataforma para el patching totalmente Automatizado de células fluorescentes en cortes cerebrales.

El sistema pudo utilizarse para automatizar el patching de neuronas fluorescentes de la capa V en cortes corticales de ratones Thy1-ChR2-EYFP, obteniendo una calidad de grabación similar en comparación con el patching manual de neuronas en cortes cerebrales de ratones de tipo silvestre. Los tiempos promedio dedicados al posicionamiento de la pipeta, la formación del gigaseal y la ruptura también se redujeron significativamente en comparación con el patching manual.

Para el patching de células no fluorescentes en ratones de tipo silvestre (que requirió detección celular manual utilizando óptica DIC), el sistema requirió interrupción del usuario durante el proceso de patching en el 47.7% de los intentos (21 de 44 intentos), principalmente causados por imprecisiones en el posicionamiento automatizado del micromanipulador o fallo del algoritmo de patching para formar un gigaseal. Para los intentos totalmente automatizados (que representaron 23 de 44 intentos, o 52.3%) y los intentos semi-automatizados (es decir, intentos que requirieron interrupciones del usuario), las tasas de lograr la configuración de célula completa exitosa (definida como una resistencia de membrana celular inferior a 300 MΩ y una corriente de mantenimiento entre -200 pA y 100 pA) fueron del 82.6% y 52.4% respectivamente, mientras que fue del 35.3% para los intentos manuales.

La resistencia del sello, la capacitancia de la membrana, la resistencia de la membrana, la resistencia de acceso y la corriente de mantenimiento no fueron significativamente diferentes entre el patching automático/semi-automático y el manual, mientras que los tiempos promedio dedicados a la colocación de la pipeta en la célula objetivo, la formación del gigaseal y la ruptura fueron significativamente más cortos para el patching automático/semi-automático en comparación con el manual. Si bien este fue un paso importante hacia la automatización completa del patching de cortes, aún no se ha logrado la grabación de patch clamp sin intervención humana de células no fluorescentes visualizadas utilizando óptica DIC.

Como sugirieron Wu et al., las limitaciones que hacen que el Autopatcher IG requiera interrupciones del usuario podrían abordarse potencialmente utilizando micromanipuladores con capacidades de posicionamiento más precisas y un algoritmo de circuito cerrado para el seguimiento continuo de la ubicación de la punta de la pipeta, pero una nueva estrategia de análisis de imágenes capaz de detectar células no fluorescentes y su implementación en el algoritmo de circuito cerrado para el seguimiento en tiempo real de la posición de la célula objetivo puede ser aún más crítica para superar la necesidad de intervención humana al usar el Autopatcher IG.

Grabaciones Automatizadas de Patch Clamp Ciego In Vivo

El primer sistema automatizado para grabaciones de patch clamp In Vivo fue desarrollado para el patching ciego (Kodandaramaiah et al., 2012). Este sistema basado en LabVIEW, llamado "autopatcher", utiliza un algoritmo que divide el proceso de patching ciego en cuatro etapas distintas. Para ejecutar este algoritmo, el autopatcher integra un conjunto de equipos estándar de patch clamp, como el portapipetas, el cabezal, el amplificador de patch y el convertidor analógico-digital, con motores lineales programables (para navegación automatizada de la pipeta), válvulas neumáticas controladas por computadora (para modulación de presión de la pipeta en circuito cerrado) y una placa digital (para medición de resistencia de la pipeta en tiempo real).

Utilizando el autopatcher, se pudieron obtener grabaciones exitosas de célula completa (definidas como menos de 500 pA de corriente de mantenimiento cuando se mantenía a -65 mV durante al menos 5 minutos) tanto de neuronas corticales como hipocampales en ratones anestesiados a una tasa del 32.9% (se obtuvieron grabaciones de gigaseal adheridas a la célula el 36% del tiempo), lo cual es similar o superior a las tasas de éxito para el patching in vivo manual reportadas en la literatura.

Además, la calidad de las grabaciones de célula completa (evaluada utilizando resistencia de acceso, corriente de mantenimiento, potencial de reposo y tiempo de mantenimiento) y el tiempo requerido para obtener grabaciones de célula completa fueron similares entre el autopatching y el patching in vivo manual. Posteriormente se demostró que el autopatcher también podía usarse para obtener grabaciones de célula completa de ratones despiertos, con la cabeza fija, ya sea inmovilizados o corriendo sobre una bola flotante.

El algoritmo de autopatching también se ha utilizado para permitir el patching simultáneo de múltiples células (es decir, multi-patching; Kodandaramaiah et al., 2018). El "multipatcher", compuesto por cuatro robots autopatching interactivos, pudo obtener grabaciones duales o triples de célula completa el 30.7% del tiempo (es decir, de 41 intentos, con cuatro pipetas de patch controladas simultáneamente en cada intento, 13 intentos llevaron a que dos o tres pipetas lograran la configuración de célula completa) en las cortezas visual y somatosensorial de ratones anestesiados, pero no pudo obtener grabaciones cuádruples. Si se considera cada pipeta individualmente, la tasa a la que se pudo obtener la configuración de célula completa fue del 31.7% (52 de 164 pipetas), lo cual es similar a la reportada para el autopatcher. Cuando se utilizó en ratones despiertos, con la cabeza fija y el cuerpo restringido, el multipatcher llevó a al menos una grabación exitosa de célula completa en el 55.7% de los intentos y grabaciones duales o triples en el 17.5% de los intentos (lo que se tradujo en una tasa de éxito del 17.3% cuando se consideró cada pipeta individualmente).

Recientemente se desarrolló un sistema automatizado similar para el patching ciego en ratones despiertos, con la cabeza fija y en comportamiento (Desai et al., 2015). Este sistema basado en MATLAB no solo automatiza los pasos clave en el patching ciego, como la penetración de la duramadre, el movimiento de la punta de la pipeta a una región objetivo, la búsqueda de una neurona, el sellado y la ruptura, sino que también permite el posicionamiento automático de las pipetas de patch en las craneotomías antes del inicio del proceso de patching, integrando una cámara y un algoritmo de procesamiento de imágenes. Utilizando este sistema, se pudieron obtener grabaciones exitosas de célula completa típicamente en 5 minutos a una tasa del 17% en ratones despiertos, con la cabeza fija, corriendo en una rueda. La calidad de la grabación, evaluada utilizando la resistencia en serie, fue comparable a la obtenida mediante patching manual, y la duración de la grabación fue de 8 minutos en promedio.

Vale la pena señalar que, aunque la tasa de éxito para el sistema basado en MATLAB fue menor en comparación con la del autopatcher (17% vs 33%), la tasa de éxito para el multipatcher en ratones despiertos, con la cabeza fija, fue muy cercana a la del sistema basado en MATLAB. La tasa de éxito relativamente baja puede deberse principalmente a la complejidad adicional involucrada en el patching en animales despiertos (por ejemplo, movimiento cerebral significativo y en gran medida impredecible debido a la locomoción) en lugar de las diferencias entre los sistemas (por ejemplo, niveles de presión utilizados para el patching, eliminación de duramadre).

Para mejorar el rendimiento de las grabaciones automatizadas de patch clamp en las profundidades del cerebro (por ejemplo, en el tálamo), se desarrolló recientemente un sistema robótico que añade navegación lateral automática de la pipeta al algoritmo de autopatching (Stoy et al., 2017). A medida que la pipeta penetra el cerebro para alcanzar una región/profundidad deseada para el patching, el sistema detecta una obstrucción (por ejemplo, un vaso sanguíneo) detectando un aumento en la resistencia de la punta de la pipeta (≥12.5% de aumento por encima de la resistencia basal). Una vez que se encuentra una obstrucción, la punta de la pipeta se retrae paralela al eje de la pipeta y la resistencia de la punta de la pipeta se registra posteriormente para establecer un valor basal. Luego, la punta de la pipeta se mueve lateralmente, se baja de nuevo a la profundidad en la que se detectó la obstrucción y se vuelve a verificar la resistencia de la punta de la pipeta para determinar si la resistencia de la punta es inferior a 200 kΩ por encima del valor basal (en cuyo caso, se presume que la punta ha eludido con éxito la obstrucción). Si la punta de la pipeta aún muestra un aumento de resistencia por encima del valor umbral, se repiten los pasos descritos anteriormente hasta que el aumento de resistencia esté por debajo del umbral o la excursión lateral exceda los 50 μm.

Utilizando este "algoritmo de evasión", la tasa de obstrucción de la punta de la pipeta al moverla a una profundidad de 3000 μm en el cerebro del ratón se redujo drásticamente (de alrededor del 75% al 18%), pero el tiempo que tardó en alcanzar la profundidad objetivo también aumentó significativamente (de 6 s a 75 s). El autopatcher que implementa el algoritmo de evasión pudo obtener grabaciones de célula completa de neuronas en el tálamo, con resistencia de acceso, corrientes de mantenimiento y potenciales de membrana en reposo que fueron comparables a los de las neuronas corticales. La tasa de éxito para una grabación de célula completa de una neurona talámica fue del 10%, lo que representó una mejora de diez veces en comparación con la obtenida sin utilizar la navegación lateral automática de la pipeta para evitar obstrucciones.

Sin embargo, una tasa de éxito del 10% en ratones anestesiados sigue siendo mucho menor en comparación con la que se puede lograr en la corteza y el hipocampo utilizando el autopatcher, y necesitaría mejorarse para que esta estrategia se convierta en una forma práctica de registrar estructuras cerebrales profundas. Como sugirieron Stoy et al., las estrategias para mejorar la colocación de la punta de la pipeta en la membrana celular, como el mapeo de la morfología celular objetivo utilizando la pipeta de patch como sonda para microscopía de conductancia iónica de barrido y la estimación del hundimiento de la membrana observando cambios en la resistencia de la punta de la pipeta en respuesta a la modulación de la presión, pueden ayudar a aumentar la tasa de éxito para las grabaciones automatizadas en tejidos más profundos.

Comparativa: Patch Clamp Automatizado vs. Manual

La automatización busca mejorar la eficiencia y la estandarización. Los sistemas automatizados han demostrado ser significativamente más rápidos que los enfoques manuales. Por ejemplo, el Autopatcher IG redujo drásticamente los tiempos de posicionamiento, formación del gigaseal y ruptura en comparación con el patching manual en cortes. De manera similar, el autopatcher in vivo logró tiempos de grabación similares o superiores a los métodos manuales.

En cuanto a las tasas de éxito, los resultados varían según el sistema y la preparación. En cortes cerebrales, el Autopatcher IG mostró tasas de éxito de célula completa notablemente más altas (82.6% para intentos totalmente automatizados, 52.4% para semi-automatizados) en células fluorescentes, en comparación con el 35.3% para intentos manuales. En el patching ciego in vivo, el autopatcher alcanzó una tasa de éxito del 32.9%, similar o superior a las tasas manuales reportadas. Sin embargo, el patching en animales despiertos o en estructuras cerebrales profundas presenta desafíos que reducen las tasas de éxito, aunque la automatización con algoritmos de evasión ha demostrado mejoras significativas incluso en estos escenarios difíciles (10% en tálamo con evasión vs 1% sin ella).

La calidad de las grabaciones (medida por parámetros como resistencia de acceso, corriente de mantenimiento y potencial de reposo) generalmente se reporta como comparable entre los métodos automatizados y manuales, lo que sugiere que la automatización no compromete la calidad de los datos electrofisiológicos obtenidos.

Desafíos y Perspectivas Futuras

A pesar de los avances significativos, el patch clamp automatizado aún enfrenta desafíos. El patching guiado por imágenes en cortes de cerebro es menos exitoso para células no fluorescentes, requiriendo a menudo intervención humana. El patching en animales despiertos es complicado por el movimiento cerebral impredecible. Acceder a estructuras cerebrales profundas sigue teniendo tasas de éxito más bajas que en la corteza o el hipocampo, aunque los algoritmos de evasión están mejorando esto.

La superación de estos desafíos probablemente requerirá micromanipuladores más precisos, algoritmos de visión por computadora más sofisticados capaces de detectar y rastrear células no fluorescentes en tiempo real, y nuevas estrategias para mejorar el contacto célula-pipeta en tejidos densos o en movimiento. La integración de la pipeta de patch con otras técnicas como la microscopía de conductancia iónica de barrido o la detección de deformación de la membrana podría ser crucial para aumentar el éxito en preparaciones complejas.

La automatización del Patch Clamp es un campo en rápida evolución que promete aumentar drásticamente la escala de los experimentos electrofisiológicos, permitiendo a los neurocientíficos estudiar la actividad neuronal a un nivel de detalle sin precedentes y con un rendimiento mucho mayor que el posible con las técnicas manuales.

Preguntas Frecuentes

¿Qué es el patch clamp automatizado?
Es una versión de la técnica de patch clamp que utiliza sistemas robóticos y algoritmos informáticos para realizar automáticamente los pasos clave del proceso, como el posicionamiento de la pipeta, la formación del sello (gigaseal) y la ruptura de la membrana para obtener grabaciones de la actividad eléctrica celular.

¿Por qué es importante automatizar el patch clamp?
La automatización aumenta significativamente el rendimiento (número de células registradas por unidad de tiempo) y la estandarización de los experimentos, lo que es crucial para estudios a gran escala y para mejorar la reproducibilidad en neurociencia.

¿Se puede usar el patch clamp automatizado tanto en preparaciones in vitro como in vivo?
Sí, existen sistemas automatizados diseñados específicamente para grabaciones en cultivos celulares o cortes de cerebro (in vitro) y para grabaciones en el cerebro de animales vivos (in vivo), incluso en animales despiertos y en movimiento.

¿Son los sistemas automatizados mejores que el patch clamp manual?
Los sistemas automatizados pueden ser más rápidos y tener tasas de éxito comparables o superiores a los métodos manuales en ciertas preparaciones (como células fluorescentes en cortes). Sin embargo, el éxito puede ser menor en preparaciones más desafiantes como células no fluorescentes, estructuras cerebrales profundas o animales en comportamiento. La calidad de la grabación suele ser comparable.

¿Qué desafíos enfrenta el patch clamp automatizado?
Los desafíos incluyen el patching de células no fluorescentes, el acceso a estructuras cerebrales profundas, el manejo del movimiento cerebral en animales despiertos y la necesidad de hardware y algoritmos más precisos y robustos.

Tabla Comparativa de Enfoques Automatizados (Basado en el texto)

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