Modelado de Trastornos Neurodesarrollo

Los trastornos del neurodesarrollo (TND) constituyen un grupo diverso de afecciones que impactan en el desarrollo del sistema nervioso central, resultando en una función cerebral alterada. Estos trastornos afectan a una proporción significativa de la población mundial, generando una considerable carga social y económica. Por ello, el interés en este campo ha experimentado un crecimiento notable en los últimos años. Sin embargo, la intrincada complejidad del desarrollo y funcionamiento del cerebro humano, sumada a las restricciones en el uso de tejido humano, dificultan su modelado. Los modelos animales han desempeñado un papel fundamental en la investigación de los mecanismos moleculares y celulares implicados, pero muchos exhiben diferencias clave respecto al fenotipo humano y, en numerosos casos, no logran recapitularlo parcial o totalmente. Aunque los modelos in vitro bidimensionales (2D) específicos de humanos han sido ampliamente utilizados para abordar algunas de estas limitaciones, carecen de características cruciales como la complejidad y la heterogeneidad. En este artículo, analizaremos las ventajas, limitaciones y futuras aplicaciones de los modelos in vivo e in vitro que se emplean actualmente para modelar los TND. Además, describiremos el reciente desarrollo de organoides cerebrales tridimensionales (3D), que ofrecen un enfoque prometedor como modelos in vitro específicos de humanos para descifrar estos complejos trastornos.

Comprendiendo los Trastornos del Neurodesarrollo

La corteza cerebral es fundamental para muchas de las funciones cognitivas superiores en humanos, como la percepción, la toma de decisiones y el lenguaje. La interrupción de los procesos altamente coordinados que regulan el desarrollo cerebral da lugar a los llamados trastornos del neurodesarrollo (TND), caracterizados por déficits cognitivos, retraso en el desarrollo y discapacidades intelectuales (DI). Entre los TND más comunes se encuentran el trastorno del espectro autista (TEA) y el trastorno por déficit de atención e hiperactividad (TDAH). Un grupo de enfermedades causadas por una formación cortical defectuosa, conocidas como malformaciones del desarrollo cortical (MDC), también pertenecen a la compleja colección de TND, y a menudo coexisten en pacientes con TEA y TDAH. Definir los mecanismos fisiopatológicos subyacentes a los trastornos del desarrollo cerebral ayudará a facilitar el tratamiento de los TND, al tiempo que contribuirá al limitado conocimiento que poseemos sobre el desarrollo del cerebro humano. Por esta razón, en los últimos años, los científicos han realizado un esfuerzo significativo para modelar tales trastornos.

Hasta hace poco, los modelos animales jugaban un papel central en la investigación de los TND; sin embargo, no pueden recapitular completamente los fenotipos clínicos, moleculares y celulares humanos. Dado el acceso limitado a tejido cerebral fetal humano debido a restricciones éticas y prácticas, el uso de sistemas modelo alternativos específicos de humanos que sean accesibles y éticamente justificados es crucial. Analizaremos los pasos básicos del desarrollo cerebral y las diferencias evolutivas entre mamíferos, así como las ventajas y limitaciones de los modelos in vivo e in vitro para TND. Finalmente, revisaremos las categorías clave de TND y MDC y los modelos utilizados para investigar los mecanismos implicados.

Perspectivas Evolutivas de la Neurogénesis en Mamíferos

El desarrollo de la corteza cerebral se inicia tempranamente en el primer trimestre de gestación, cuando las células neuroepiteliales (NE), la población fundadora de progenitores neurales ubicada en la parte más rostral del tubo neural, se dividen simétricamente para expandir el área neuroepitelial. Las NE, que forman la zona ventricular (ZV) de la corteza en desarrollo, son células polarizadas que extienden dos delgados procesos: uno contactando el lado apical y otro contactando el lado basal del cerebro en desarrollo (pial). Poco después del inicio de la corticogénesis, se transforman en células de glía radial apical (aRG). Las aRG se dividen simétricamente, expandiendo el conjunto de progenitores, y asimétricamente, dando lugar a neuronas directamente o indirectamente a través de la generación de otras células progenitoras. Entre estos progenitores se encuentran los progenitores intermedios (PI) y las células de glía radial basal (bRG) que colonizan la zona subventricular (ZSV) y la ZSV externa (oZSV), respectivamente. Después de su generación, las neuronas recién nacidas adoptan una morfología multipolar y, guiadas por los procesos basales de las células de glía radial, migran desde la ZV y ZSV hacia la placa cortical (PC) en desarrollo. La generación neuronal continua conduce a la formación secuencial de capas corticales (L1-L6) de manera de adentro hacia afuera, donde las neuronas de capas profundas forman L5 y L6, y las neuronas de capas superiores forman L2, L3 y L4.

Aunque los pasos principales de la neurogénesis son comunes entre mamíferos, la corteza humana está enormemente expandida, lo que se cree que es la base de las habilidades intelectuales únicas de los humanos. Un sello distintivo de la corteza humana, así como de la de otros primates y especies giradas, es el agrandamiento de las capas supragranulares, que se originan a partir de un conjunto único de progenitores, los progenitores de la oZSV. En especies giradas, las bRG son la población de progenitores neurales (NPC) más abundante en la ZSV, y a nivel celular, son altamente heterogéneas. Por el contrario, las células similares a bRG en especies lisencéfalas como los ratones son pocas en número y se localizan en la parte superior de la ZSV. En especies giradas, las bRG presentan una alta capacidad proliferativa, mientras que en ratones son principalmente neurogénicas. Así, en especies giradas, y en particular en humanos, la oZSV es más gruesa, y sus células progenitoras desempeñan un papel significativo en la formación de pliegues corticales. Las fuerzas mecánicas han contribuido en gran medida a la aparición de una corteza plegada, siendo la adhesión intercelular de las neuronas migrantes un factor crucial que sustenta el plegamiento cortical. Además, uno de los principales elementos que influyen en el plegamiento cortical es la matriz extracelular (MEC), con componentes de la MEC humana que definen las propiedades mecánicas de la corteza en desarrollo. El análisis transcripcional en cerebros de ratón y primate ha llevado a la identificación de genes específicos de primates y humanos que regulan la expansión del neocórtex. Ejemplos característicos de tales genes específicos de humanos son NOTCH2NL, que contribuye a la rápida evolución de la corteza humana expandida, y ARHGAP11B, que aumenta su tamaño y plegamiento. Se descubrieron genes específicos de primates y bRG en muestras de cerebro fetal humano, como TMEM14B, DAG1, KCNK10, HP1BP3. Además, se encontró que el gen hominino-específico TBC1D3 aumenta la señalización ERK en las bRG humanas y, por lo tanto, su capacidad proliferativa. Un estudio reciente reveló que una única sustitución de lisina por arginina en el TKTL1 humano conduce a un mayor número de bRG y una mayor neurogénesis que en los neandertales. Sin embargo, los genes específicos de humanos o las isoformas específicas de humanos recientemente identificadas no pueden explicar las diferencias fenotípicas y morfológicas observadas en la evolución humana, por lo que también se ha prestado atención a las secuencias no codificantes y reguladoras. Estudios genómicos y epigenómicos comparativos han identificado regiones en el linaje humano llamadas regiones aceleradas humanas (HAR), cambios en regiones no codificantes enriquecidas en potenciadores del desarrollo, y regiones llamadas potenciadores ganados humanos (HGE). Estas regiones regulan la expresión génica de genes neurodesarrollos clave cruciales, algunos de los cuales están asociados con la formación de patrones en la corteza frontal, como TBR1. Más allá de estos, se propusieron otros genes asociados con el tamaño de la corteza frontal, como FGF17 y EMX2. Todo lo anterior conduce eventualmente a un aumento en el número neuronal acompañado de un aumento no análogo en el tamaño del área cerebral, lo que a su vez lleva a la girificación cortical. Curiosamente, se ha encontrado que variantes en genes específicos de humanos, genes con patrón de expresión específico de humanos o HAR y HGE están enriquecidos en pacientes con TND, lo que sugiere que los cambios específicos de humanos son importantes no solo para la evolución del cerebro humano, sino también para los trastornos relacionados con el cerebro.

Sistemas Modelo: Ventajas y Desventajas en el Estudio del Desarrollo Cerebral y la Enfermedad

Modelos in vivo

Los modelos animales se han utilizado durante muchos años para diseccionar los mecanismos y factores causantes de enfermedades implicados en los TND, proporcionando una gran ventaja sobre los tejidos humanos cuyo uso es limitado. Entre los modelos animales que se han utilizado ampliamente para estudiar el desarrollo cerebral y las enfermedades relacionadas con el cerebro se encuentran el pez cebra (Danio rerio) y la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster). Su ciclo de vida corto y su alta similitud genómica con los humanos los hacen ideales para seleccionar múltiples genes candidatos de forma relativamente rápida. Drosophila contiene casi el 87% de los genes implicados en la función neurológica y el 75% de los genes implicados en la función neurodesarrollo. De manera similar, el pez cebra comparte casi el 70% de homología con los genes humanos, y sus procesos neurodesarrollos están altamente conservados a través de la evolución. El embrión de pollo (Gallus gallus) también ha sido una herramienta valiosa en el neurodesarrollo de vertebrados debido a su gran tamaño, crecimiento rápido, fácil accesibilidad para visualización y manipulación experimental, y rentabilidad. Aunque se ha logrado un gran avance en la investigación de trastornos relacionados con el cerebro utilizando estos modelos animales, es definitivo que están distantes de la perspectiva evolutiva humana. Para cerrar esta brecha, los científicos han recurrido a otros sistemas modelo, como los roedores, para descifrar los mecanismos moleculares y celulares que rigen los TND. El modelo de ratón ha sido ampliamente utilizado porque presenta un tiempo de reproducción relativamente rápido con varias crías. Además, presenta más del 95% de similitud con el genoma humano, lo que permite una manipulación genómica precisa de los genes candidatos. Sin embargo, el uso de ratones también presenta algunas limitaciones, ya que carece de varias características específicas de humanos, como la girificación de la corteza. Se han realizado pruebas de comportamiento en roedores para modelar los déficits de comportamiento humanos en individuos con TND. Los modelos de ratón exhiben varios déficits de comportamiento relacionados con TND humanos, incluyendo impedimentos cognitivos, defectos en el aprendizaje y la memoria, hiperactividad y comportamientos similares al autismo, pero otros no se pueden recapitular con precisión, lo que sugiere que la evaluación de funciones cerebrales superiores en el cerebro lisencéfalo es desafiante. Para superar estas limitaciones, se propusieron los primates no humanos (PNH) como modelos potenciales. El PNH más utilizado es el mono (Macaca mulatta), que presenta una gran cantidad de similitudes con el cerebro humano en cuanto a función cognitiva, pero también en términos de características anatómicas, estructurales, moleculares y celulares. Debido a su largo período reproductivo y las exigencias de alojamiento, solo recientemente se han comenzado a utilizar en la investigación de TND. Sin embargo, con las ventajas de la manipulación génica transitoria in vivo (p. ej., electroporación in utero) y la tecnología CRISPR/Cas9 (cambios precisos de nucleótidos e inserciones/deleciones de transgenes), se ha vuelto económico y eficiente en tiempo generar PNH genéticamente manipulados. Estos modelos animales sirven como herramientas de investigación significativas para estudiar aspectos genéticos de la manifestación de TND con grandes potenciales traslacionales.

Sistemas Modelo in vitro Específicos de Humanos

Las sorprendentes diferencias entre los modelos animales y los humanos en términos de desarrollo cerebral plantean preguntas sobre el valor de la información obtenida de los estudios en animales. Considerando que el uso de embriones o fetos humanos está éticamente restringido, los modelos in vitro específicos de humanos podrían ser un enfoque complementario a los estudios en animales. Un avance importante ha sido la diferenciación de células madre embrionarias humanas (hESC) y células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) en todos los diferentes linajes celulares, posiblemente incluyendo el linaje neuronal. Con el uso de diferentes medios de cultivo, las hESC y hiPSC se han diferenciado en cultivos neuronales bidimensionales (2D), es decir, cultivos de células monocapa, incluyendo neuronas dopaminérgicas, neuronas GABAérgicas, neuronas serotoninérgicas, neuronas granulares dentadas del hipocampo, neuronas motoras y neuronas hipotalámicas. Además de los cultivos neuronales, también se han generado astrocitos, oligodendrocitos y microglia. Estos cultivos se han utilizado para estudiar la diferenciación neuronal, la actividad neuronal y la morfología neuronal. También se implementó el co-cultivo de neuronas y células gliales para generar un sistema más complejo y estudiar la comunicación célula a célula. Considerando que las iPSC permiten la generación de cantidades escalables de tejidos de pacientes, facilitan la identificación de objetivos terapéuticos a través de la selección de fármacos. Además, aparte de su contribución a la caracterización de TND y las pruebas de fármacos, el potencial de las iPSC reside en su capacidad para servir como material inicial para terapias celulares basadas en células madre específicas de pacientes. Aunque los cultivos humanos 2D trascendieron a los modelos animales en cuanto al estudio de mecanismos especie-específicos, surgen limitaciones de su uso, especialmente en lo que respecta a su incapacidad para recapitular la homeostasis celular y la diversidad. En particular, la falta de diversidad celular e interconexión celular entre diferentes regiones cerebrales, incluso en el sistema de co-cultivo, puede llevar a la subestimación de los mecanismos celulares y moleculares implicados.

Dadas estas restricciones, el uso de cultivos celulares tridimensionales (3D), a saber, los organoides cerebrales que se han desarrollado en la última década, es pionero en el estudio del desarrollo cerebral y la enfermedad. Los organoides cerebrales son tejidos 3D autoorganizados derivados de células madre que imitan la citoarquitectura, la composición celular y el perfil de expresión génica del cerebro fetal humano. El principio de su generación se basa en la clasificación celular y el compromiso de linaje espacialmente restringido. Este sistema modelo se caracteriza por una alta diversidad celular, donde diferentes NPC, neuronas recién nacidas y maduras, así como células gliales, forman una estructura altamente orquestada y organizada. Estudios de expresión génica y electrofisiológicos han demostrado que los organoides cerebrales se asemejan con precisión al primer y segundo trimestres del cerebro fetal humano. Además, los datos de secuenciación de ARN de célula única sugieren que modelan con precisión el desarrollo cortical a nivel molecular. Los organoides cerebrales (OC), el primer protocolo de organoides cerebrales, se generaron a partir de iPSC basándose en sus propiedades intrínsecas para generar neuroectodermo. Este protocolo se ha utilizado desde entonces para imitar el desarrollo y la evolución temprana del cerebro humano, así como las enfermedades cerebrales humanas. Se encontraron áreas con características regionales específicas como el prosencéfalo dorsal y ventral, el plexo coroideo, el hipocampo y la retina dentro de estos organoides. Curiosamente, estas regiones pueden formar conexiones entre sí, lo que hace posible el modelado de la interconectividad. Protocolos más recientes han intentado dirigir la identidad regional de una manera más guiada utilizando factores de patrón. Ejemplos de organoides cerebrales de región única incluyen organoides de la corteza, hipotálamo, cerebelo y mesencéfalo. Además, se han desarrollado protocolos que generan organoides fusionados (o assembloides) para recapitular las conexiones de diferentes regiones cerebrales. La fusión de organoides con patrón dorsal y ventral hizo posible modelar la migración de neuronas inhibitorias y excitatorias entre y dentro de estas dos áreas, así como la formación de un circuito neuronal local inhibitorio-excitatorio. La generación de assembloides corticoestriatales para modelar los circuitos corticoestriatales humanos del prosencéfalo también ha sido un gran logro, ya que se cree que las disfunciones en los circuitos neurales de esta vía contribuyen a los TND. Se ha establecido el co-cultivo de organoides de la eminencia ganglionar medial (MGEO) y organoides corticales, generando organoides fusionados MGE-corticales humanos, para investigar la interacción compleja entre regiones cerebrales específicas. Siguiendo este enfoque, se desarrolló la fusión de organoides talámicos y OC humanos para modelar proyecciones axonales, con el fin de estudiar las bases moleculares de actividades humanas complejas como el procesamiento sensoriomotor y la atención. Se demostró que los diferentes protocolos de organoides recapitulan más fielmente los aspectos clave del desarrollo del cerebro humano que otros sistemas modelo. En general, las nuevas metodologías en tecnología de células madre han ampliado nuestra caja de herramientas para modelar TND. La elección del sistema modelo apropiado depende del enfoque de la investigación y de la pregunta de investigación que debe responderse.

Uso del Sistema Correcto en el Modelado de Trastornos del Neurodesarrollo

Los trastornos del neurodesarrollo comprenden un grupo heterogéneo de trastornos caracterizados por una plétora de fenotipos clínicos como deterioro cognitivo, déficits de comunicación, habilidades psicomotoras deterioradas e incapacidad para alcanzar hitos del desarrollo. Los TND incluyen TEA, TDAH, DI, trastornos de la comunicación, trastornos motores, de aprendizaje y del habla del neurodesarrollo. Este grupo de trastornos se caracteriza por altas tasas de comorbilidad entre varias enfermedades dentro de este grupo diagnóstico. Por ejemplo, los individuos con TEA y DI a menudo exhiben MDC, un amplio espectro de anomalías corticales. Las MDC se clasifican según los procesos de desarrollo perturbados; así, las alteraciones en la proliferación conducen a microcefalia y macrocefalia, los defectos en la migración neuronal resultan en heterotopia periventricular/subcortical y lisencefalia, y los déficits en la organización cortical conducen a polimicrogiria. Las manifestaciones clínicas de las MDC incluyen epilepsia, características autistas, DI y retraso en el desarrollo, acoplando las MDC con trastornos neuropsiquiátricos. Por ejemplo, individuos con síndrome de Rett presentan microcefalia y TEA al mismo tiempo, mientras que en pacientes con síndrome de Seckel y síndrome de Angelman exhiben microcefalia y DI. Pacientes con síndrome de Prader-Willi y síndrome de Timothy sufren tanto de DI como de TEA, mientras que en el síndrome del cromosoma X frágil, las características de TEA, DI y TDAH están presentes simultáneamente. Curiosamente, mientras que las causas monogénicas predominan en las MDC, los TND generalmente exhiben una fisiopatología poligénica. Sin embargo, la etiología de estos diferentes síndromes no está bien entendida hasta ahora y, por lo tanto, se ha realizado un tremendo esfuerzo para escudriñar su causalidad utilizando diferentes sistemas modelo que se presentarán en las siguientes secciones. Además, presentaremos las MDC basándonos en el fenotipo neuropatológico observado: (i) presencia de neuronas ectópicas (heterotopia periventricular y heterotopia subcortical), (ii) cambio del índice de girificación (lisencefalia y polimicrogiria), (iii) tamaño cerebral anormal (microcefalia y macrocefalia) y cómo podemos modelarlos utilizando los sistemas modelo mencionados anteriormente.

Trastornos del Espectro Autista

El trastorno del espectro autista implica déficits en la comunicación social y comportamientos repetitivos, al tiempo que presenta un modo complejo de herencia que concierne a loci genéticos en varios cromosomas. Los genes candidatos para el TEA tienen roles clave en el neurodesarrollo y/o la neurotransmisión. Estos genes codifican proteínas reguladoras, como factores de transcripción implicados en las sinapsis neuronales y redes relevantes para la neuroinflamación y la neurotransmisión. El TEA sigue siendo uno de los TND más heterogéneos, con más de 800 genes asociados. Algunos de los síndromes monogénicos más estudiados correlacionados con el TEA en humanos son: síndrome del cromosoma X frágil (FXS) (mutación en FMR1), síndrome de Rett (RTT) (mutación en MECP2) y esclerosis tuberosa (mutaciones en TSC1 y TSC2), que se analizarán en los siguientes párrafos.

El uso de modelos animales ha logrado y sigue logrando enormes avances en la comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes al FXS. El modelo de ratón knockout (KO) de Fmr1 exhibió déficits sinápticos, morfología anormal de las espinas dendríticas y defectos de neurotransmisión, proporcionando oportunidades para evaluar nuevos objetivos farmacológicos. Aunque los estudios en modelos de ratón FXS revelaron una vía metabotrópica deficiente, su modulación condujo a ensayos clínicos fallidos. La falta de ensayos clínicos efectivos hasta ahora puede atribuirse a las diferencias fundamentales de desarrollo, bioquímicas y fisiológicas entre los modelos animales y los humanos. De hecho, el análisis del transcriptoma de organoides de prosencéfalo FXS reveló un número significativo de genes con expresión alterada, mientras que solo unos pocos se expresaron diferencialmente en el cerebro de ratón FXS. Además, este análisis mostró un gran número de genes superpuestos expresados diferencialmente en organoides de prosencéfalo FXS y tejidos cerebrales fetales. Los genes expresados diferencialmente en los organoides de prosencéfalo FXS se asociaron con la migración neuronal, la axonogénesis, la neurogénesis y la diferenciación neuronal. Además, se logró el rescate de los déficits de desarrollo en organoides de prosencéfalo FXS mediante la inhibición de la vía PI3K, pero no de la vía metabotrópica que estaba alterada en los modelos de ratón FXS, lo que sugiere que los organoides cerebrales imitan con mayor precisión el fenotipo FXS. Aunque la desregulación de la vía PI3K se ha relacionado con la patogénesis del FXS, la modulación de esta vía aún no se ha realizado en ensayos clínicos. Además, considerando que la inhibición farmacológica de la vía PI3K podría rescatar algunos de los defectos de desarrollo en organoides de prosencéfalo FXS, el uso de la vía PI3K como objetivo en futuras estrategias terapéuticas podría ser prometedor. En general, todo lo anterior indica que los organoides cerebrales humanos podrían servir como modelos preclínicos para identificar objetivos terapéuticos específicos de humanos.

Para investigar el RTT, se han utilizado ampliamente modelos de ratón transgénicos y tejidos humanos post-mortem. Tanto los ratones mutantes para Mecp2 como los pacientes humanos exhiben anomalías motoras, síntomas neurológicos robustos incluyendo marcha descoordinada y movimiento espontáneo reducido, déficits de aprendizaje y memoria, alteraciones metabólicas, aumento del estrés oxidativo, convulsiones y una esperanza de vida acortada. Sin embargo, los síntomas neurológicos en ratones son menos graves y no recapitulan completamente el fenotipo humano. Cultivos neuronales bidimensionales diferenciados a partir de iPSC derivadas de pacientes que albergan mutaciones en MeCP2 mostraron maduración deteriorada, menos sinapsis, desequilibrio excitatorio/inhibitorio (E/I), menor tamaño del soma y defectos funcionales en la actividad de disparo. Las recientes innovaciones de los organoides cerebrales se utilizaron para el modelado del RTT, revelando una neurogénesis deteriorada en MGEO y organoides corticales humanos, así como déficits en la neurogénesis y la diferenciación neuronal en los OC. Por último, el ensamblaje de organoides de prosencéfalo dorsal (DFO) y ventral (VFO) a partir de iPSC derivadas de pacientes con RTT reveló defectos en la migración de interneuronas, lo que sugiere un modelo valioso para comprender el RTT durante las primeras etapas del desarrollo neural.

Estudios en roedores han demostrado que la pérdida de función de Tsc1/2 en la esclerosis tuberosa impacta múltiples procesos en diferentes etapas de desarrollo, incluyendo la morfología y migración neuronal, la plasticidad sináptica y la función glial. La pérdida de la línea germinal de Tsc1 en ratones resultó en letalidad embrionaria antes del desarrollo cerebral, por lo tanto, es necesaria la manipulación genética espacial y temporal en etapas muy tempranas del neurodesarrollo cortical. La pérdida de Tsc1 en neuronas corticales durante el desarrollo embrionario en ratones provocó varias anomalías neurológicas, neuronas ectópicas agrandadas y actividad convulsiva. Sin embargo, aunque los modelos de ratón KO condicionales han sido y seguirán siendo una herramienta de investigación poderosa, esta patología puede resultar de aspectos celulares y moleculares únicos del desarrollo del cerebro humano. Además, aunque un alelo mutante de TSC1/2 es suficiente para dar lugar a la esclerosis tuberosa en pacientes, los modelos animales heterocigotos demuestran síntomas sutiles o nulos. Los déficits en el aprendizaje, la memoria y el comportamiento social en ratones Tsc1+/- y Tsc2+/- surgieron en ausencia de neuropatología y convulsiones, lo que indica que los modelos animales no recapitulan fielmente el fenotipo humano. En contraste, el uso de células madre humanas permite investigar las primeras etapas de la neuropatología de la esclerosis tuberosa e identificar las características específicas de humanos de esta enfermedad. Se ha propuesto que la haploinsuficiencia de TSC1/2 podría desencadenar los patomecanismos responsables de la formación de tubérculos corticales, el sello neuropatológico de la esclerosis tuberosa. Las neuronas diferenciadas a partir de hESC en 2D mostraron transmisión sináptica alterada, que fue rescatada por la inhibición de la vía mTORC1. Además, las NPC 2D diferenciadas a partir de iPSC específicas de pacientes exhibieron un tamaño aumentado y una proliferación mejorada, consistente con la activación de la señalización mTORC1, así como una diferenciación neuronal alterada. De manera similar, las células madre neurales primitivas (pNSC) 2D derivadas de pacientes mostraron una mayor capacidad proliferativa, mientras que las neuronas diferenciadas exhibieron agrandamiento del soma, crecimiento de neuritas perturbado y conexiones alteradas con otras células. Curiosamente, aunque las neuronas TSC2+/- derivadas de iPSC específicas de pacientes mostraron hiperactivación de mTORC1 y un tamaño celular aumentado asociado, solo las neuronas TSC2-/- exhibieron la hiperactividad y la desregulación transcripcional observadas en los tubérculos corticales. Un avance en la investigación de la esclerosis tuberosa ha sido el desarrollo de OC derivados de pacientes que recapitularon la aparición de tumores cerebrales y regiones corticales displásicas. Más importante aún, este sistema modelo reveló la presencia de una nueva población de progenitores de interneuronas, llamadas células CLIP, que dan lugar tanto a tumores como a lesiones de tubérculos corticales, destacando la importancia de utilizar un sistema modelo adecuado en la investigación del neurodesarrollo.

Tabla 1: Modelos utilizados para investigar Trastornos del Neurodesarrollo y Malformaciones del Desarrollo Cortical

Trastorno por Déficit de Atención e Hiperactividad

El trastorno por déficit de atención e hiperactividad es un TND conductual caracterizado por DI, falta de atención, desorganización y dificultad para completar tareas. Aunque suele presentarse en niños, los síntomas pueden persistir durante la edad adulta. Los hallazgos de modelos animales sugieren que el TDAH se caracteriza por déficits en los sistemas dopaminérgico, noradrenérgico y serotoninérgico, así como defectos más fundamentales en la neurotransmisión. La etiología, aunque en gran parte desconocida, incluye factores genéticos y ambientales, mientras que la evidencia muestra que la exposición a disruptores endocrinos, especialmente ftalatos y bisfenol A (BPA), podría ser causante. Estudios de asociación de genoma completo han identificado varios genes candidatos para el TDAH, incluyendo parkin 2 (PARK2), loci del neuropéptido Y y genes de la familia del receptor de glutamato metabotrópico (GRM). Esta etiología poligénica, junto con la variabilidad en el fenotipo clínico y la raíz psiquiátrica del TDAH, lo hacen extremadamente difícil de modelar.

Se han utilizado varios modelos animales para modelar el TDAH, incluyendo modelos genéticos, ambientales y químicamente inducidos, como las ratas espontáneamente hipertensas (SHR), las ratas de alta excitabilidad de Nápoles (NHE) y los ratones neonatales con 6-hidroxidopamina (6-OHDA). Dado que la desregulación en la señalización y función dopaminérgica del prosencéfalo se ha asociado con el TDAH, se han generado roedores knockout del transportador de dopamina (DAT-KO) mediante el agotamiento del gen SLC6A3 para estudiar el TDAH. De hecho, los ratones DAT-KO presentaron hiperactividad, desregulación del sueño y déficits cognitivos, mientras que las ratas DAT-KO mostraron un déficit en la memoria de trabajo y alteraciones conductuales que afectan el procesamiento de la recompensa y la toma de decisiones. Además, los modelos de ratón con TDAH sugirieron que los factores ambientales en las etapas prenatal y perinatal, incluyendo modificaciones epigenéticas, parto prematuro y tabaquismo materno durante el embarazo, son factores de riesgo importantes para el TDAH.

Sin embargo, el limitado conocimiento que tenemos del origen de desarrollo del TDAH y los mecanismos moleculares y celulares implicados llevó al desarrollo de modelos in vitro específicos de humanos rápidos y de bajo costo. Se ha informado de la generación de iPSC derivadas de pacientes con TDAH, ofreciendo el potencial único de cerrar la brecha entre las asociaciones genéticas y de redes neuronales en el TDAH en un entorno específico de humanos. La selección de fármacos y productos químicos se logró desarrollando organoides cerebrales, proporcionando un modelo más barato, rápido y biológicamente relevante para comprender la predisposición ambiental al TDAH. Por ejemplo, el estudio del efecto del BPA, que también se sabe que afecta el neurodesarrollo de roedores, demostró que el sistema de organoides de prosencéfalo permitió la investigación cuantitativa de las consecuencias de la exposición al BPA. Además, con la ayuda de tecnología robótica, se generó un enfoque automatizado de cultivos de organoides de mesencéfalo humano a gran escala para seleccionar los efectos tóxicos generales y específicos dopaminérgicos de varios compuestos. No obstante, la falta de la barrera hematoencefálica, que muchos productos químicos atraviesan, puede tener un efecto importante en la comprensión de los mecanismos subyacentes en relación con la toxicidad. Además, la falta de cualquier lectura conductual en los sistemas modelo 2D/3D no es despreciable y debe tenerse en cuenta. Por lo tanto, se acepta comúnmente que un solo modelo no puede capturar todos los rasgos de un trastorno cerebral complejo y que se necesita una combinación de diferentes enfoques para cumplir con este requisito.

Otras Enfermedades del Neurodesarrollo

Aunque la atención se ha centrado en el TEA y el TDAH, especialmente en los últimos años, otros TND como la DI, los trastornos motores, las discapacidades de aprendizaje y del habla están en gran medida sin caracterizar. Nuestro conocimiento sobre estos TND se ha derivado principalmente de estudios comparativos en sujetos humanos, ya que la investigación en modelos animales es limitada y aún no se han realizado estudios in vitro 2D/3D. Considerando que las pruebas genéticas moleculares, junto con los estudios de asociación de genoma completo (GWAS), han identificado genes causantes en individuos con estos TND, es de gran importancia profundizar en los mecanismos etiopatogénicos utilizando herramientas de investigación tanto in vivo como in vitro.

Malformaciones del Desarrollo Cortical Caracterizadas por la Presencia de Neuronas Ectópicas

Heterotopia Periventricular

Los individuos con heterotopia periventricular (PH) presentan una corteza normal sin grandes interrupciones o cambios. Sin embargo, a nivel celular, los pacientes exhiben cúmulos de sustancia gris organizados como láminas o nódulos cerca de los ventrículos laterales. Estas áreas de sustancia gris representan una subpoblación de neuronas que no migran hacia la placa cortical. Los pacientes con PH sufren varios tipos de convulsiones y epilepsia, posiblemente debido a la formación de una red neuronal local y una conectividad sináptica aberrantes. Se ha propuesto que los principales mecanismos etiopatogénicos de la PH pueden ser mutaciones genéticas o factores ambientales como la radiación, lesiones e infecciones. Si bien originalmente la PH se consideraba meramente un trastorno de la migración neuronal, recientemente se ha prestado atención a la importancia de la proliferación y diferenciación de las NPC en la manifestación de la enfermedad.

El gen FLNA ligado al cromosoma X, que estabiliza el citoesqueleto, fue uno de los primeros genes asociados con la PH utilizando modelos animales. El modelo de ratón con knockdown (KD) de Flna mostró la importancia de la organización de la glía radial y la función de las células progenitoras durante la neurogénesis y la migración. De manera similar, un modelo de hurón con PH exhibió nódulos neuronales ubicados en la corteza y fibras gliales radiales desorganizadas. La importancia de la dinámica de los microtúbulos y la actina en la patogénesis de la PH también se destacó con la identificación de MAP1B, que codifica la proteína asociada a microtúbulos 1B, como un factor de riesgo para la PH. Curiosamente, mientras que las mutaciones patogénicas en la proteína asociada a microtúbulos EML1 conducen a heterotopia subcortical en banda en humanos, la interrupción de Eml1 resultó en la corteza heterotópica (HeCo) en ratones mutantes. Los ratones HeCo exhibieron una población de aRG ubicadas lejos de la ZV, que mostraban cilios primarios perturbados y función del aparato de Golgi alterada. Además, se demostró que Fat4-Dchs1 y Yap son reguladores clave en la neurogénesis de mamíferos, sugiriendo que los cambios en el número de células progenitoras y su capacidad de diferenciación llevaron a neuronas heterotópicas en la subcorteza. Cabe destacar que un factor de señalización Hippo que sirve como modulador molecular de Fat4 y Dchs1, llamado Mob2, también ha sido implicado en la patogénesis de la PH. El KD de Mob2 en la corteza de ratón en desarrollo alteró la distribución neuronal y provocó un número y posición ciliares deteriorados dentro de las neuronas migrantes. Mecanísticamente, también se ha propuesto que el tráfico de vesículas y/o membranas desde la red trans-Golgi cambia el transporte de moléculas polarizadas a la superficie de las células gliales radiales, interrumpiendo así su proliferación y migración durante el desarrollo cortical. Por ejemplo, las mutaciones en el gen ARFGEF2, que codifica el factor de intercambio de guanina 2 asociado a Brefeldina A (BIG2) del tráfico de vesículas, están implicadas en la manifestación de la PH en humanos. Además, la interrupción de la E3 ubiquitina ligasa NEDD4L conduce a PH en humanos, con mutantes que muestran sensibilidad a la degradación del proteasoma en modelos de ratón. Las mutaciones en INTS8 también se han relacionado con TND graves caracterizados por PH, deterioro cognitivo profundo, dismorfia de miembros y facial, y epilepsia, con pacientes que exhiben perturbaciones transcripcionales globales.

Aunque se ha realizado una extensa investigación en los últimos años utilizando modelos animales, estos sistemas no lograron recapitular fielmente el fenotipo humano. Trabajos más recientes en sistemas modelo específicos de humanos 2D y 3D destacaron la importancia de la morfología y función de las NPC en la manifestación de la PH. Específicamente, los OC deficientes en DCHS1 y FAT4 derivados de pacientes presentaron numerosos nódulos neuronales en posiciones ventriculares, zonas germinales mal organizadas y NPC morfológicamente alteradas. Además, el KD de estos genes en OC control condujo a un patrón de migración aberrante en un subconjunto de neuronas. Curiosamente, el análisis de secuenciación de ARN de célula única reveló una subpoblación de neuronas con genes desregulados implicados en la guía axonal, la migración neuronal y el patrón, elucidando el fenotipo observado en pacientes, donde solo un subgrupo de neuronas no logra migrar, generando nódulos ectópicos. Entre los genes expresados diferencialmente en el cúmulo ectópico de neuronas específico de pacientes, GNG5, que se expresa naturalmente en las NPC, fue el más regulado al alza, lo que indica que su regulación a la baja es esencial para una migración neuronal adecuada. La sobreexpresión de GNG5 en OC control provocó la delaminación prematura de las NPC, indujo alteraciones en la morfología de las NPC y condujo a defectos en la migración neuronal. Por lo tanto, ahora se cree que la interrelación entre la morfología de las NPC y el comportamiento de migración alterado de las neuronas recién nacidas es una explicación molecular y celular específica de humanos para la manifestación de la PH. La importancia de un modelo específico de humanos para estudiar la PH también se destacó en una publicación que describe una nueva mutación de novo en la isoforma específica de humanos de PLEKHG6, que es responsable de alterar la diferenciación de los progenitores y la migración neuronal aguas abajo de RhoA, destacando nuevamente la necesidad del uso de sistemas modelo específicos de humanos. Además, mediante el uso de organoides cerebrales, también se han implicado mecanismos celulares no autónomos en la etiología de la PH al modelar el papel de ECE2, demostrando la importancia de la organización extracelular en la manifestación de la PH. De manera similar, las mutaciones en LGALS3BP, que codifica una proteína secretada que interactúa con la MEC, se han asociado con PH, autismo y convulsiones. La deficiencia de LGALS3BP condujo a un aumento del grosor del cinturón apical, prevención de la delaminación de las NPC, neuronas ectópicamente localizadas y disminución de la longitud ciliar de las RG en los OC, lo que indica que su expresión afecta la corticogénesis. Este estudio sugirió que la MEC, con LGALS3BP como mediador de las señales de la MEC, es crucial para el desarrollo cortical humano a nivel celular. Curiosamente, los pacientes con mutaciones en LGALS3BP también exhiben cambios en el índice de girificación local, características de otras MDC, lo que refuerza la comorbilidad entre diferentes MDC.

Heterotopia Subcortical en Banda

La heterotopia subcortical en banda (SBH) se caracteriza por una banda lisa de sustancia gris en las porciones superficiales y medias de la sustancia blanca. Surge cuando las neuronas recién generadas no migran a la ubicación correcta y se acumulan en la sustancia blanca. En humanos, la SBH se asocia con DI, convulsiones resistentes a fármacos y epilepsia. La mayoría de las pacientes son mujeres portadoras de mutaciones en el gen DCX ligado al cromosoma X, que exhiben bandas gruesas difusas de neuronas ectópicas. Debido a la naturaleza estocástica de la inactivación del cromosoma X, las mujeres con mutaciones en DCX presentan un estado mosaico con dos poblaciones de neuronas: una que expresa DCX y migra correctamente, y la deficiente que da lugar a la banda heterotópica. En hombres con deficiencia de DCX, las neuronas carecen completamente de la proteína, dando lugar a la corteza lisencéfala "lisa" más grave. Otro locus que se ha relacionado con la SBH contiene el gen PAFAH1B1, que codifica la proteína LIS1. La SBH asociada a LIS1 exhibe bandas posteriores delgadas o intermedias, siendo la heterotopia posterior más grave que la heterotopia anterior. Además, los individuos con mutaciones en EML1 exhiben SBH, megalencefalia, polimicrogiria y agenesia del cuerpo calloso. En general, las MDC resultan de mutaciones puntuales únicas en genes de desarrollo críticos o de variaciones en varios loci genéticos, aumentando la probabilidad de enfermedad. Curiosamente, la interrupción de genes comunes puede llevar a fenotipos de enfermedad divergentes, y la penetrancia variable de las variantes genéticas complejiza aún más la manifestación clínica general.

Aunque el KD de Dcx en ratas ha proporcionado información valiosa sobre la epileptogenicidad de la SBH, solo albergan una SBH unilateral, no imitando con precisión el fenotipo humano. La interrupción de Eml1 conduce a ratones mutantes HeCo, un modelo único que se ha utilizado ampliamente para descifrar la base molecular de la SBH. Los ratones HeCo exhiben anomalías progenitoras, con algunas RG que abandonan la ZV y se dividen en ubicaciones basales. Las RG de los ratones HeCo presentaron cilios primarios alterados y mecanismos del aparato de Golgi perturbados que probablemente contribuyeron a la delaminación anormal de las RG. La contribución de los cilios primarios en la fisiopatología de la SBH no es sorprendente, considerando su papel en la regulación del comportamiento de las RG. No obstante, aunque los modelos de ratón HeCo exhiben heterotopia, no presentan todo el espectro de patologías encontradas en humanos, como polimicrogiria y megalencefalia, lo que indica una manifestación de enfermedad diferencial en humanos y modelos no humanos.

La aparición de la tecnología de células madre de vanguardia ha sido extremadamente valiosa para descifrar la etiopatogénesis de la SBH. Los progenitores corticales bidimensionales diferenciados a partir de iPSC mutantes para EML1 exhibieron formación de cilios primarios perturbada y función alterada del aparato de Golgi. Además, los organoides de prosencéfalo deficientes en EML1 presentaron rosetas neurales ectópicas acumuladas en el lado basal de la ZV y cúmulos neuronales heterotópicos. Las RG en la ZV de los organoides mutantes exhibieron orientación del huso alterada y cilios primarios más cortos, lo que podría impactar directamente la delaminación de las RG. Además, la secuenciación de ARN de célula única en las poblaciones de progenitores ectópicos mostró una regulación al alza de los marcadores de bRG y componentes de la MEC específicos de humanos. Aunque este sistema modelo reveló los patomecanismos implicados en la deficiencia de EML1, la etapa de desarrollo de los organoides no nos permite estudiar el alcance completo de las MDC causadas por el deterioro de EML1.

Malformaciones del Desarrollo Cortical Caracterizadas por Índice de Girificación Alterado

Lisencefalia

La lisencefalia se caracteriza por una migración neuronal defectuosa y resulta en la falta de desarrollo de surcos y giros, lo que lleva a una superficie cerebral lisa. Abarca un amplio grupo de malformaciones cerebrales con anomalías en la formación de giros que van desde la agiria (ausencia de giros) hasta la oligogiria (girificación reducida). Además de estas, la paquigiria (giros anchos) y la SBH (doble corteza) también se incluyen en el espectro de la lisencefalia. Dependiendo del grado de malformación, los pacientes pueden presentar retraso en el desarrollo y discapacidades mentales. Entre los mecanismos clave que conducen a la lisencefalia se encuentra la interrupción del desarrollo adecuado de giros y surcos. Es causada por factores genéticos y no genéticos, como la falta de sangre oxigenada en el cerebro durante el desarrollo fetal o infecciones virales de la madre del feto. Curiosamente, muchos genes asociados son causantes también de la manifestación de la SBH, lo que apoya la noción de que las deficiencias en genes comunes resultan en cuadros clínicos divergentes. El síndrome de Miller-Dieker (MDS) es una malformación cortical caracterizada por lisencefalia a menudo asociada con microcefalia, que conduce a DI y mortalidad. Este síndrome es causado por deleciones en la banda humana 17p13.3, que incluye PAFAH1B1 (proteína LIS1). Las causas genéticas de la lisencefalia también involucran el gen DCX, que es esencial para la migración neuronal adecuada. Otras causas genéticas de la lisencefalia incluyen mutaciones en ARX, que juega un papel importante en el desarrollo del prosencéfalo, RELN, que codifica la proteína reelin, y otros genes como KIF2A, KIF5C, CDK5, VLDLR, ACTB, ACTG1 y TUBG1, que, sin embargo, no se han modelado adecuadamente hasta ahora.

La función de Lis1 y las vías asociadas a él se han estudiado en modelos de ratón para la lisencefalia. Los ratones con una reducción gradual en la dosis de Lis1 en capas corticales desorganizadas, cerebelo, hipocampo y bulbo olfatorio han sido modelos adecuados para estudiar el MDS. Estos modelos han ayudado a demostrar deterioros de la coordinación motora y la cognición, graves interrupciones de la fisiología celular y sináptica del hipocampo, así como defectos de migración in vivo. Además, NDEL1, que interactúa con el complejo LIS1/dineína, también ha sido implicado en la patogénesis de la lisencefalia. Específicamente, los cerebros de ratones nulos para Ndel1 exhibieron graves defectos de estratificación cortical y déficits hipocampales. Otra causa genética asociada con la lisencefalia clásica y la SBH son las mutaciones en el gen DCX. Los ratones mutantes para Dcx mostraron una laminación alterada en el hipocampo, lo que provocó déficits en el aprendizaje. Sin embargo, el cerebro pequeño y liso de los ratones dificulta el modelado del amplio espectro de fenotipos de manera precisa. Por ejemplo, a pesar de la interrupción del hipocampo, los ratones mutantes para Dcx presentaron una corteza normal con patrones regulares de neurogénesis neocortical y migración neuronal. En contraste, la inhibición de DCX mediante ARN de interferencia pequeño (siRNA) en cortes corticales embrionarias de rata provocó graves defectos en la migración neuronal. Estos resultados opuestos sugieren que hay un papel más complejo para DCX, destacando la necesidad de modelos específicos de humanos.

La diferenciación de iPSC en células neurales 2D proporciona un sistema modelo para escudriñar aún más la regulación molecular y celular de la lisencefalia y, en particular, la función de DCX en el neurodesarrollo. Las células madre neurales (NSC) con expresión ausente o reducida de la proteína DCX mostraron diferenciación retardada, migración y formación de neuritas deterioradas, recapitulando el fenotipo lisencéfalo. Como se mencionó anteriormente, en la corteza humana en desarrollo, la oZSV, donde se localizan las células IP y bRG, es más gruesa en comparación con otros mamíferos. Mientras que las IP están conservadas entre humanos y ratones, las bRG son menos numerosas en la corteza en desarrollo de ratones lisencéfalos. Además, las bRG humanas se han asociado con el aumento evolutivo del tamaño cortical del cerebro humano. Todo lo anterior puede explicar por qué los ratones deficientes en Lis1 presentaron un fenotipo más leve en comparación con los pacientes humanos con mutaciones heterocigotas en PAFAH1B1. La implementación de cultivos de organoides cerebrales ha demostrado el efecto de las mutaciones de lisencefalia del MDS en procesos biológicos y tipos celulares distintos. Específicamente, se ha logrado una recapitulación del linaje de desarrollo desde NE hasta RG, IP y bRG con resolución espacial y temporal, lo que no se podría haber logrado con los métodos anteriores. Esto ha destacado la vulnerabilidad de las NE y las bRG específicas de humanos en el MDS, mientras que las aRG y las IP se vieron menos afectadas. Los organoides de prosencéfalo con MDS exhibieron un tamaño pequeño, una tasa de expansión reducida, cambios en el plano de división de las RG, un aumento de la neurogénesis y una arquitectura del nicho cortical alterada. Finalmente, la implicación de la MEC en la girificación cortical y, por lo tanto, en la manifestación de las MDC caracterizadas por un índice de girificación alterado no es insignificante, considerando que los pacientes que albergan mutaciones en LGALS3BP exhiben una girificación alterada, mientras que su sobreexpresión en el cerebro de ratón promovió el plegamiento cortical, lo que indica que LGALS3BP regula la expansión y la girificación cortical. Aunque las bRG parecen tener un efecto robusto en la girificación y, por lo tanto, en la aparición de MDC con índice de girificación alterado, debido a la ausencia casi total de bRG en ratones, es difícil estudiar el comportamiento de las bRG en este modelo. En contraste, en los organoides cerebrales, hay células similares a bRG con características coincidentes in vivo como morfología, identidad molecular y comportamiento mitótico. Sin embargo, aún no se ha determinado cómo las células bRG derivadas in vitro recapitulan las propiedades funcionales y la identidad molecular de las células bRG primarias, lo que hace que la sinergia de los modelos in vivo e in vitro sea esencial.

Polimicrogiria

La polimicrogiria (PMG) es una MDC caracterizada por la presencia de múltiples giros anormalmente pequeños que conducen a una superficie cortical plegada irregularmente con un índice de girificación aumentado. Los individuos con PMG presentan deterioro cognitivo, epilepsia y retraso en el desarrollo. Se ha asociado con el mal funcionamiento de varios genes, incluyendo TUBA1A, TUBB2B, TUBB3, GPR56, WDR62, EOMES, SCN3A, así como causas ambientales. Considerando que las bRG son responsables del plegamiento cortical en especies giradas, la PMG podría ser el resultado de un aumento de la migración y/o un exceso de bRG. Es un trastorno altamente heterogéneo en términos de distribución topográfica, características clínicas y de imagen, así como niveles de gravedad, variando desde formas focales hasta afectación bilateral. La PMG a menudo ocurre concurrentemente con otras MDC, como la lisencefalia, la macrocefalia y la heterotopia, pero es probablemente la menos caracterizada entre las MDC más comunes, por lo que se debe hacer un mayor esfuerzo para identificar los mecanismos implicados.

Solo se han reportado algunos modelos animales que albergan mutaciones en genes asociados a la PMG, que se mencionan aquí. No obstante, no logran recapitular con precisión el fenotipo humano. Por ejemplo, el modelo de ratón deficiente en Tubb2 exhibió adelgazamiento cortical y un aumento de la apoptosis de las neuronas corticales, lo que provocó letalidad perinatal. De manera similar, mientras que los individuos portadores de mutaciones en EML1 exhiben un amplio espectro de deterioros, incluida una corteza similar a la PMG, los modelos de ratón HeCo no lograron imitar este fenotipo. Además, aunque la pérdida de GPR56 en humanos conduce a PMG frontoparietal bilateral, en ratones condujo a neuronas corticales ectópicas debido a la sobremigración neuronal, aberraciones estructurales en los pies terminales de las RG y brechas en la membrana basal pial. En general, los ratones mutantes para Gpr56 exhibieron una laminación cortical desorganizada y una malformación similar a la de un adoquín. Aunque los modelos de ratón han sido una herramienta valiosa en la investigación de las MDC, el uso de cortezas giradas complejas es esencial para descifrar los patomecanismos implicados en la PMG. Curiosamente, el promotor GPR56 e1m asociado a la PMG impulsó preferentemente la expresión génica en neuronas GABAérgicas de la corteza en desarrollo en monos tití comunes, lo que indica una posible conexión con la epilepsia asociada a la mutación de GPR56. Además, la expresión alterada de SCN3A, que codifica el canal de sodio dependiente de voltaje Na V 1.3 enriquecido en el cerebro, interrumpió la formación de giros corticales y provocó heterotopia de la sustancia gris cortical en un modelo animal de hurón, destacando la necesidad de la función de los canales iónicos en las primeras etapas del desarrollo cortical.

Aunque se han dado los pasos iniciales para modelar la PMG, los modelos animales no pueden imitar correctamente el fenotipo clínico humano, por lo tanto, la necesidad de sistemas modelo específicos de humanos es urgente. Además, la falta de modelos específicos de humanos para varios genes relacionados con la PMG, como GPR56, impide la caracterización y el modelado de la enfermedad, por lo que es necesario tomar medidas en esta dirección. La sobreexpresión de variantes mutantes de SCN3A en cultivos neuronales primarios humanos 2D atenuó la ramificación de las neuritas, lo que respalda la noción de que SCN3A regula el desarrollo neuronal. El análisis del transcriptoma en OC deficientes en EML1 reveló una regulación al alza de los marcadores de bRG y componentes de la MEC específicos de humanos en la población de rosetas neurales ectópicas, lo que respalda la implicación de las bRG en la fisiopatología de la PMG. Considerando que los genes de la MEC regulados al alza COL1A2, COL3A1 y LUM se han relacionado con la expansión y el plegamiento cortical, es tentador especular que el aumento de su actividad desempeña un papel en el desarrollo del fenotipo similar a la PMG en pacientes portadores de mutaciones en EML1. Además, el modelado del gen WDR62 asociado a la microcefalia utilizando OC mostró una interrupción de las bRG, lo que indica que este sistema modelo podría ser una herramienta valiosa para profundizar en las vías implicadas en la PMG. No obstante, la ausencia de plegamiento en los organoides cerebrales limita el modelado de los fenotipos asociados a la PMG. La eliminación de PTEN en OC humanos condujo a la expansión de la población de NPC y a un plegamiento superficial sustancial, lo que indica que estamos un paso más cerca de diseñar organoides cerebrales plegados que puedan utilizarse para el modelado de la PMG. Si bien se han tomado medidas para generar organoides plegados, los protocolos existentes son preliminares. A diferencia de la girificación cortical, que tiene lugar alrededor de la semana 30 de gestación, cuando el cerebro fetal está compuesto en gran parte por neuronas, los organoides plegados contienen principalmente NPC, por lo que imitan una etapa de desarrollo anterior. En general, si bien el arrugamiento de los organoides es equivalente a la girificación cortical, existen diferencias biológicas cruciales, lo que indica que este campo aún está en desarrollo.

Malformaciones del Desarrollo Cortical Caracterizadas por Tamaño Cerebral Anormal

Microcefalia

La microcefalia se caracteriza por un crecimiento cerebral reducido y se define como una circunferencia craneal con ≤-3 DE. Resulta de un desequilibrio entre la producción de progenitores y la muerte celular, y conduce a un número reducido de células neuronales y gliales. Es una de las MDC más estudiadas, con una extensa investigación que muestra que algunas de las causas de la microcefalia primaria (presente al nacer) son deficiencias en las vías de reparación del ADN, mutaciones en genes que codifican proteínas centrosomales, roturas de doble cadena, exposiciones tóxicas, infección intrauterina y condiciones metabólicas. La microcefalia secundaria (manifestación postnatal) puede estar asociada con defectos de migración, aumento de la muerte celular y trastornos metabólicos. Además, la microcefalia también puede ser una característica clínica en otros TND y síndromes como el RTT, el síndrome de Angelman y el síndrome de Seckel, mientras que las infecciones maternas por el virus Zika (ZIKV) conducen al síndrome congénito de Zika (CZS), con lactantes que presentan microcefalia grave.

El pez cebra ha sido un modelo animal útil para descifrar las implicaciones genéticas y los mecanismos moleculares de la microcefalia. La inactivación del gen asociado a la microcefalia similar al huso anormal (Aspm), que está asociado con la manifestación de la microcefalia primaria autosómica recesiva (MCPH), resultó en un tamaño de cabeza reducido en el pez cebra. Los mutantes de pez cebra Fnacd2 también presentaron microcefalia debido al aumento de la apoptosis dependiente de p53. Además, los ratones inmunocomprometidos (modelos AG129, C57BL/6) e inmunocompetentes (modelos Swiss Jim Lambert (SJL), ICR, STAT2 KO) han sido una herramienta útil para investigar los efectos de la infección por ZIKV. Además, los modelos de ratón se han utilizado ampliamente para investigar los efectos de la interrupción de los genes asociados a la MCPH en el cerebro en desarrollo. La pérdida de CPAP, una proteína crucial para la biogénesis de los centriolos, indujo la muerte celular dependiente de p53, lo que interrumpió gravemente los cerebros de ratón embrionarios. Sin embargo, las mutaciones de pacientes en ratones llevaron a fenotipos microcefálicos leves y no proporcionaron información sobre los mecanismos celulares y moleculares. Además, no hay evidencia clara de que una mutación causante de enfermedad en el cerebro de ratón sea análoga a la microcefalia humana. Curiosamente, la inactivación de Aspm en el hurón, una especie con una corteza girada más grande y una mayor diversidad de NPC que los ratones, provocó microcefalia grave con un área de superficie cortical significativamente reducida. Para recapitular con mayor precisión la patogénesis, la neurofisiología y el desarrollo terapéutico del CZS, también se han utilizado PNH, ya que presentan similitudes con los humanos en la biología gestacional. Específicamente, los macacos recapitularon características clave de la microcefalia humana a través de la infección por ZIKV. Sin embargo, las demandas de cría y manejo de PNH, así como la generación de animales transgénicos, son desafiantes, destacando la necesidad de sistemas modelo que no solo sean fisiológicamente relevantes para el cerebro humano, sino también fáciles de manipular.

Los modelos in vitro 2D y 3D específicos de humanos han contribuido a descifrar la complejidad de la microcefalia, que era difícil de dilucidar en los modelos in vivo existentes. La diferenciación de iPSC derivadas de pacientes con síndrome de Seckel en 2D reveló una proliferación reducida y cilios alargados en las NPC mutantes para CPAP. Curiosamente, las NPC de Seckel exhibieron un retraso en el desensamblaje ciliar y una transición G1-S retrasada, lo que condujo a la diferenciación prematura de las NPC. En la misma línea, la diferenciación 2D de hESC en NPC que albergan mutaciones en el gen KNL1 asociado a la microcefalia, que es esencial para la señalización del punto de control del ensamblaje del huso, reveló un crecimiento celular reducido, alta muerte celular y diferenciación prematura a expensas de la proliferación de las NPC. CDK5RAP2, que codifica la proteína 2 asociada a la subunidad reguladora de CDK5, fue el primer gen utilizado para estudiar la microcefalia en organoides cerebrales. La generación de OC derivados de pacientes ha demostrado que los cambios en la orientación del huso mitótico afectan la proliferación de los progenitores y conducen a la diferenciación neuronal prematura. Además, el modelado de las mutaciones de ASPM demostró la capacidad de los OC humanos para recapitular la microcefalia. A su vez, los OC mutantes para CPAP mostraron un tamaño reducido —una característica clave de la microcefalia— y un mayor número de cilios que afectaron el modo de división de los progenitores y condujeron a una neurogénesis prematura. De manera similar, una mutación en CPAP identificada en pacientes con MCPH indujo la muerte celular en los OC y llevó a la generación de organoides más pequeños. Además, la mutación en CPAP provocó una desorientación del huso de las NPC que resultó en una diferenciación prematura. Finalmente, la eliminación de WDR62, que codifica una proteína centrosomal, en los OC reveló una longitud ciliar alterada, una disminución de la proliferación de las NPC y una diferenciación neuronal prematura que eventualmente condujo a una reducción en el tamaño de los organoides mutantes. La estructura y función ciliares perturbadas en los modelos 2D/3D de microcefalia destacan la necesidad de los cilios primarios en la regulación de procesos de desarrollo cruciales, incluida la proliferación y diferenciación de las NPC. Por último, los organoides cerebrales han recapitulado con éxito los efectos de la infección por ZIKV en el desarrollo cortical, revelando una infección específica de las RG, especialmente en la ZV, lo que resulta en una reducción de las zonas proliferativas.

Macrocefalia

La macrocefalia se define como una circunferencia craneal con ≥+2 DE para una edad y género determinados, originándose de una mayor tasa de proliferación de progenitores, así como de defectos en la señalización de factores de crecimiento. Se identificaron mutaciones heterocigotas con pérdida de función en PTEN en pacientes con macrocefalia y asociadas concurrentemente con TEA. Los individuos con mutaciones en PTEN exhiben agrandamiento cerebral y anomalías de la sustancia blanca. No obstante, las mutaciones en PTEN no tienen los mismos efectos en las diferentes áreas cerebrales. El escalado anormal de diferentes regiones cerebrales podría indicar conectividad alterada, la presencia de tejido ectópico o inervación anormal de áreas cerebrales cruciales, lo que puede contribuir a los fenotipos conductuales. Curiosamente, la pérdida de PTEN conduce a un aumento en la señalización PI3K-AKT-mTOR, que a su vez se ha sugerido que tiene un papel importante en la macrocefalia. Por ejemplo, las mutaciones en la pequeña GTPasa RAB39B, que interactúa con los componentes de PI3K, están asociadas con macrocefalia ligada al cromosoma X, TEA y DI. Además, las mutaciones activadoras de AKT3 se han relacionado con macrocefalia y polimicrogiria.

Las anomalías neurodesarrollos prenatales en la macrocefalia son difíciles de comprender debido al acceso limitado a tejidos cerebrales humanos. Por lo tanto, los modelos animales genéticamente modificados siguen siendo una estrategia necesaria para escudriñar la patogénesis de la macrocefalia a nivel molecular y conductual. Los ratones KO de Rab39b exhibieron macrocefalia y comportamientos similares al autismo. En particular, presentaron una mayor tasa proliferativa y una disminución de la salida del ciclo celular de las NPC, lo que condujo a la expansión del pool de progenitores. Los modelos de ratón Pten+/- presentaron un crecimiento excesivo cerebral regional, que es similar al agrandamiento cerebral en pacientes adultos con PTEN-TEA. Este fenotipo puede estar asociado con un aumento de la gliogénesis debido a la reducción de la supresión de la vía PI3K. Además, los ratones mutantes para Akt3 que albergan una mutación missense dominante mostraron una actividad de señalización mejorada y un tamaño cerebral aumentado.

En humanos, la mayoría de las neuronas de las capas superiores derivan de la oZSV, donde las bRG son abundantes. Por el contrario, en roedores, las células similares a bRG son menos numerosas. Por lo tanto, las iPSC humanas y los organoides cerebrales derivados de iPSC son una plataforma valiosa para estudiar la macrocefalia, ya que el cerebro humano exhibe un tamaño y complejidad cortical aumentados. De hecho, los OC mutantes para RAB39b exhibieron un fenotipo más grave en comparación con los modelos de ratón KO, destacando el valioso papel de los organoides cerebrales en el modelado del desarrollo temprano humano. Estos organoides cerebrales mutantes tuvieron un aumento más prominente en el pool de progenitores neurales y las neuronas de las capas superiores en comparación con los ratones mutantes, lo que explica el fenotipo severo que apareció en los organoides mutantes. De manera similar, la eliminación de PTEN resultó en organoides cerebrales agrandados y plegados. Las mutaciones homocigotas de PTEN en organoides aumentaron la señalización de la vía PI3K, promovieron la reentrada al ciclo celular de las NPC y retrasaron transitoriamente la diferenciación neuronal, lo que resultó en la expansión de la población de progenitores. Sin embargo, el hecho de que la sincronización del desarrollo entre los organoides y los ratones mutantes no sea compatible, muestra la importancia de realizar comparaciones paralelas entre los modelos de ratón y los organoides cerebrales humanos.

Organoides Cerebrales como Herramienta para Modelar Trastornos Neurodegenerativos y Neuropsiquiátricos

Además de las aplicaciones de los organoides cerebrales en la investigación de TND, también pueden utilizarse para dilucidar procesos alterados en enfermedades neurodegenerativas y neuropsiquiátricas. La poca relevancia fisiológica del cerebro de los modelos animales, el número limitado de terapias, así como la ineficacia de los efectos del tratamiento en los trastornos neurodegenerativos, dictan la necesidad de herramientas revolucionarias. Además, la necesidad de un análisis no invasivo de tejido derivado de pacientes y un sistema eficaz de selección de fármacos ha contribuido a la aparición de cultivos de organoides cerebrales. Aunque los organoides cerebrales no recapitulan el cerebro envejecido, se han utilizado para modelar varios trastornos neurodegenerativos. Dado que estos trastornos se asocian con períodos prolongados de enfermedad prodrómica, donde las anomalías celulares se acumulan sin manifestarse como síntomas clínicos, los organoides nos permiten investigar estos cambios celulares tempranos que impulsan la neurodegeneración. Además, los avances en la tecnología de organoides han permitido el cultivo prolongado de organoides cerebrales, lo que ha llevado a una mayor diversidad celular y maduración neuronal. Estos organoides maduros desarrollaron redes neuronales espontáneamente activas y adquirieron rasgos de neuronas maduras, lo que sugiere que, además de modelar procesos neurodesarrollos tempranos, tienen el potencial de modelar funciones de orden superior del cerebro humano. Los organoides se han utilizado para modelar la enfermedad de Alzheimer (EA), la enfermedad de Parkinson (EP), la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la demencia frontotemporal, la enfermedad de Huntington y la atrofia muscular espinal. Considerando que los sistemas modelo 2D carecen del complejo entorno extracelular necesario para recapitular la agregación de proteínas, como la deposición extracelular de placas de amiloide-β (Aβ) mal plegadas, el sello molecular de la EA, las condiciones de cultivo 3D proporcionan una herramienta poderosa para investigar la patología del Aβ. Además, la aparición de organoides de mesencéfalo humano ha sido pionera en la investigación de la EP, que se caracteriza por la pérdida de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra compacta y la presencia de inclusiones de Lewy. Del mismo modo, la complejidad del cerebro humano en cuanto a aspectos fisiológicos, funcionales y estructurales del desarrollo cerebral, así como el aumento de las habilidades cognitivas, han señalado la necesidad de sistemas modelo específicos de humanos para estudiar enfermedades neuropsiquiátricas. En esta dirección, los organoides han proporcionado información valiosa sobre los patomecanismos implicados en la esquizofrenia, el trastorno bipolar, la psicosis y la depresión. En particular, el modelado del efecto de los genes relacionados con la esquizofrenia utilizando organoides cerebrales reveló estructuras de rosetas neurales alteradas y proliferación alterada de las NPC, que se rescató mediante el antagonismo de WNT, lo que indica que los organoides pueden ser una herramienta valiosa para la selección de fármacos. Teniendo en cuenta que los pacientes con TND pueden exhibir simultáneamente trastornos neurodegenerativos o neuropsiquiátricos, el uso de un sistema modelo que pueda recapitularlos fielmente es de gran potencial.

Conclusión y Perspectivas Futuras

La creación de una corteza cerebral funcional requiere la coordinación de procesos de desarrollo cruciales, como la proliferación y diferenciación de los progenitores, la migración neuronal y, finalmente, su maduración e integración en la red neuronal existente. Las interrupciones de estos procesos complejos y delicados conducen a una plétora de alteraciones cerebrales, los TND. Su manifestación clínica abarca retraso en el desarrollo, epilepsia, DI, pero también diversas anomalías estructurales que afectan el tamaño, el grosor y el plegamiento de la corteza. Comprender la etiología molecular de los TND es crucial para el manejo del paciente. No obstante, su naturaleza multifactorial y poligénica dificulta su modelado. Aunque los modelos de roedores y otros animales han sido la base para descifrar las vías implicadas en los TND, el uso de modelos específicos de humanos es esencial. En esta dirección, los cultivos in vitro 2D y 3D derivados de iPSC muestran un gran potencial para modelar las patologías neurodesarrollos humanas. Hemos analizado tanto los modelos in vivo como in vitro utilizados para estudiar los TND.

Aunque el tremendo progreso en la tecnología de células madre y organoides ha decodificado complejas vías patogénicas, los organoides cerebrales presentan numerosas limitaciones como sistema modelo. En particular, no se desarrollan más allá de la etapa de un cerebro prenatal y no pueden recapitular la organización espacial de seis capas de la placa cortical. Sin embargo, los avances recientes en el patrón de organoides cerebrales han llevado a un desarrollo in vitro prolongado, lo que permite niveles significativos de madurez. Además, a pesar de la existencia de bRG, los OC no han presentado plegamiento en la superficie pial ni girificación. Además, las neuronas E/I, aunque funcionales, son menos maduras en comparación con las neuronas adultas. Por lo tanto, la diversidad celular en los organoides aún debe enriquecerse más, dado también que carecen de tipos celulares no neuronales como la microglia, lo que podría lograrse con nuevos protocolos de patrón o con co-cultivos con tipos celulares de linaje no neuronal en el futuro. La falta de vascularización, que restringe el suministro de nutrientes y oxígeno, ha sido otro obstáculo significativo para la supervivencia a largo plazo de estos cultivos, ya que se acumula un núcleo necrótico dentro de los organoides. Para abordar la falta de vascularización, se ha realizado el injerto de organoides cerebrales humanos en cerebros de ratones adultos. Curiosamente, se observaron redes neuronales funcionales dentro del injerto, así como conectividad sináptica del injerto al huésped en estos ratones. Otra herramienta prometedora para superar tales problemas son los organoides en un chip. Un informe reciente sobre el riñón humano ha examinado el flujo de fluidos en la vascularización y maduración de organoides renales derivados de hiPSC. Los diseñaron en una cámara impresa en 3D que condujo a la expansión de progenitores endoteliales dentro de los organoides y, finalmente, a la formación de vasos sanguíneos de una manera mejorada por el flujo. Otra limitación es la variabilidad de los diferentes cultivos de organoides, que depende de la calidad de la línea celular fundadora (es decir, la línea y el pasaje de las iPSC). Por último, un obstáculo importante para el uso de organoides cerebrales para modelar TND es la falta de cualquier lectura conductual de los cultivos in vitro. En resumen, centrarse en la arquitectura humana de seis capas, la vascularización in vitro, el patrón y un mayor refinamiento en la identidad del tejido pueden ofrecer una gran promesa hacia el desarrollo de un sistema modelo específico de humanos más robusto. No obstante, el desarrollo avanzado y el injerto de organoides en cerebros de animales constituyen una zona gris ética, lo que lleva a los eticistas a preguntarse si estos experimentos son esenciales para responder a una pregunta científica o si se están superando los límites.

Preguntas Frecuentes sobre Trastornos Neurodesarrollo y Modelado

¿Qué son exactamente los trastornos del neurodesarrollo?

Son un grupo de condiciones que afectan cómo se desarrolla el cerebro y el sistema nervioso. Conducen a dificultades en el aprendizaje, la comunicación, el movimiento, el control emocional y el comportamiento. Ejemplos comunes incluyen el TEA, el TDAH y las discapacidades intelectuales.

¿Por qué es tan difícil estudiar los TND en humanos?

El cerebro humano es increíblemente complejo, y su desarrollo ocurre principalmente antes del nacimiento y en la infancia temprana. Acceder a tejido cerebral humano en desarrollo o estudiar directamente los procesos en tiempo real es limitado por razones éticas y prácticas.

¿Qué modelos animales se utilizan para estudiar los TND?

Se utilizan diversos animales, desde invertebrados como la mosca de la fruta y el pez cebra, hasta vertebrados como el pollo, roedores (ratones y ratas) y primates no humanos. Cada uno tiene ventajas, como ciclos de vida rápidos o similitud genómica, pero a menudo no recapitulan completamente los fenotipos complejos de los TND humanos.

¿Qué ventajas ofrecen los modelos in vitro humanos?

Los modelos in vitro, especialmente los derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC), permiten estudiar células específicas de humanos y sus interacciones en un entorno controlado. Esto es crucial para identificar mecanismos especie-específicos y probar terapias directamente en células humanas.

¿Qué son los organoides cerebrales 3D?

Son estructuras tridimensionales autoorganizadas derivadas de células madre humanas que imitan aspectos clave del desarrollo y la estructura del cerebro fetal humano. Contienen diversos tipos de neuronas y células gliales organizadas en capas, lo que les permite modelar la complejidad y heterogeneidad de las redes neuronales de una manera que los modelos 2D no pueden.

¿Pueden los organoides cerebrales replicar todas las características de los TND?

Aunque son herramientas poderosas, los organoides actuales tienen limitaciones. No alcanzan la madurez completa del cerebro adulto, carecen de vascularización y no recapitulan el plegamiento cortical complejo de un cerebro humano maduro. Tampoco permiten evaluar comportamientos, que son un aspecto clave de muchos TND.

¿Cómo se utilizan los organoides cerebrales en la investigación de TND específicos?

Se crean organoides a partir de iPSC de pacientes con TND (como TEA, RTT, esclerosis tuberosa, microcefalia, macrocefalia) para estudiar cómo las mutaciones genéticas afectan el desarrollo celular, la migración neuronal, la formación de sinapsis y la organización de las capas corticales. También se utilizan para modelar el impacto de factores ambientales o probar la efectividad de posibles fármacos.

¿Cuál es el futuro del modelado de TND?

La investigación se dirige a superar las limitaciones de los organoides actuales, mejorando su maduración, vascularización y complejidad (por ejemplo, mediante la creación de assembloides que fusionan diferentes regiones cerebrales). La combinación de modelos in vivo y in vitro específicos de humanos es vista como la estrategia más prometedora para comprender y tratar los TND.

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