La exploración del cerebro intacto y vivo presenta desafíos únicos. La complejidad de su estructura tridimensional y la necesidad de observar procesos dinámicos a nivel celular y subcelular requieren herramientas de visualización excepcionales. En este contexto, la microscopía de fluorescencia ha emergido como una técnica poderosa, y dentro de ella, la Microscopía de Dos Fotones con Escaneo Láser (TPLSM por sus siglas en inglés) se ha destacado como una herramienta fundamental para la neurociencia.
A diferencia de las técnicas de microscopía convencionales que utilizan la absorción de un solo fotón para excitar la fluorescencia, la TPLSM se basa en un proceso físico distintivo: la absorción simultánea de dos fotones. Para que esto ocurra, dos fotones deben llegar a la molécula fluorescente prácticamente al mismo tiempo (en menos de 1 femtosegundo). Dado que la energía necesaria para la transición molecular se obtiene de la suma de las energías de ambos fotones, cada fotón individual tiene una energía relativamente baja. Esto se traduce en el uso de luz de mayor longitud de onda para la excitación, típicamente en el rango del infrarrojo cercano (700-1000 nm).
- Ventajas Clave para el Tejido Cerebral
- Funcionamiento y Adquisición de Imágenes
- Aplicaciones en la Neurociencia: Estructura y Función
- Fotomanipulación y Escalas Espaciales
- Limitaciones de Profundidad de Penetración
- Principios Teóricos de la Absorción de Dos Fotones
- Medición y Coeficientes
- Desarrollo y Compuestos Fluorescentes
- Emisión de Dos Fotones
- Preguntas Frecuentes sobre Microscopía de Dos Fotones en Neurociencia
Ventajas Clave para el Tejido Cerebral
El uso de luz en el rango del infrarrojo cercano confiere la primera gran ventaja de la microscopía de dos fotones: una menor Dispersión en el tejido biológico. Las longitudes de onda más largas interactúan menos con los componentes del tejido, lo que permite que la luz de excitación penetre a mayores profundidades antes de dispersarse o ser absorbida, abriendo una ventana a estructuras cerebrales más profundas que las accesibles con microscopía convencional o confocal.
La segunda característica crucial es que la generación de señal de Fluorescencia en la microscopía de dos fotones depende de forma no lineal de la intensidad de la luz de excitación. Específicamente, es proporcional al cuadrado de la intensidad. Esta dependencia no lineal es altamente beneficiosa porque confina la generación de fluorescencia estrictamente al punto focal del láser. En cualquier momento, los fotones de fluorescencia se generan solo localmente en el volumen focal.
Esto tiene una consecuencia directa y muy importante: la TPLSM posee una 'sección óptica intrínseca'. A diferencia de la microscopía confocal, no necesita un pinhole (un pequeño orificio espacial) delante del detector para rechazar la luz dispersada y lograr imágenes de un plano focal definido. En la microscopía de dos fotones, la fluorescencia se genera principalmente solo donde la intensidad del láser es máxima (en el foco), por lo que la luz que llega al detector proviene casi exclusivamente de ese punto. De hecho, en TPLSM, el pinhole confocal debe omitirse para recoger la mayor cantidad posible de fotones de fluorescencia generados. En resumen, la excitación con longitud de onda más larga y la capacidad de sección óptica intrínseca hacen que la TPLSM sea mucho menos sensible a la dispersión de la luz en comparación con la microscopía confocal, permitiendo una visión clara en las profundidades del tejido vivo.
Funcionamiento y Adquisición de Imágenes
La microscopía de dos fotones es una técnica de Escaneo Láser. Un haz de láser pulsado de alta potencia se enfoca a través de un objetivo de microscopio hasta un punto de luz de tamaño micrométrico en la muestra. En cada instante, la microscopía de escaneo láser típicamente recoge luz de fluorescencia de una única ubicación en la muestra. La información espacial se obtiene moviendo ('escaneando') el foco del láser dentro del tejido.
Por ejemplo, el escaneo de tipo ráster (línea a línea) de un plano horizontal es una técnica estándar para adquirir imágenes bidimensionales (2D). La adquisición plano a plano de 'pilas' de imágenes es un método estándar para recopilar datos de fluorescencia de un volumen de muestra tridimensional (3D). Existen excepciones, como los microscopios multifocales que generan fluorescencia simultáneamente en múltiples focos, pero estos requieren detectores de cámara y se han aplicado rara vez in vivo, por lo que el escaneo punto a punto es el enfoque dominante.
Aplicaciones en la Neurociencia: Estructura y Función
Las características especiales de la TPLSM la hacen idealmente adecuada para el estudio de procesos dinámicos a nivel celular y subcelular en el sistema nervioso intacto. Los eventos dinámicos que se pueden monitorear incluyen cambios estructurales (es decir, cambios morfológicos de células individuales o migración celular), así como la actividad eléctrica y bioquímica de las células (por ejemplo, la generación de potenciales de acción, flujos iónicos a través de la membrana o actividades enzimáticas).
Además de la imagenología de la dinámica neuronal, la TPLSM también ha demostrado ser beneficiosa para medir el flujo sanguíneo capilar, así como la actividad en células gliales no eléctricamente excitables. Un requisito clave para la imagenología de dos fotones es el marcaje fluorescente de las estructuras de interés, ya sea con un marcador anatómico o una sonda funcional. Marcar todo generalmente no es útil; más bien, es deseable un marcaje disperso y de alto contraste de células particulares. Actualmente, hay varias técnicas disponibles para el marcaje específico y disperso.
Tras la demostración inicial de las ventajas de la TPLSM para la investigación neurocientífica, el primer informe sobre imagenología funcional in vivo de neuronas individuales se publicó en 1997. Experimentos similares más recientes han permitido, por ejemplo, cargar una neurona piramidal individual en el neocórtex de una rata anestesiada con un indicador de calcio fluorescente. Este tipo de experimento ha sido útil para medir la dinámica del calcio en dendritas neuronales y estudiar la excitación dendrítica. También es posible visualizar fácilmente una población celular en el cerebro vivo utilizando una tinción de contraste negativo simple. Las tinciones negativas pueden ayudar a identificar y dirigir específicamente las células.
Fotomanipulación y Escalas Espaciales
Temprano se observó que la TPLSM también es una herramienta útil para la fotomanipulación precisa. Este tipo de aplicación es complementaria al modo de imagenología y ha proporcionado resultados importantes en cortes cerebrales durante la última década. Aún necesita ser adaptada para condiciones in vivo, quizás impulsada por los desarrollos recientes de proteínas de canal catiónico activadas por luz.
La microscopía de dos fotones cubre escalas espaciales entre una micra y un milímetro. Su resolución espacial es lo suficientemente buena para resolver estructuras sinápticas como espinas dendríticas y botones axónicos en el cerebro intacto. Numerosos estudios han investigado la dinámica estructural de espinas dendríticas o botones axónicos, especialmente aquellos que modifican el esquema de conectividad y, por lo tanto, probablemente contribuyen a la plasticidad de los circuitos neuronales. En el neocórtex, se ha encontrado que la dinámica estructural es particularmente alta en las células microgliales, las células inmunocompetentes del cerebro; en su 'estado de reposo', la microglía expande y retrae continuamente sus finos procesos, en una escala de minutos, presuntamente cumpliendo una función homeostática. En comparación con estos estudios de cambios morfológicos, las mediciones funcionales a nivel de sinapsis individual in vivo son más difíciles; las señales de calcio en terminales presinápticas o espinas dendríticas no se han estudiado in vivo todavía. Una dificultad obvia es que las pulsaciones tisulares restantes inducidas por los latidos cardíacos y la respiración dificultan las mediciones a escala micrométrica, incluso con una buena amortiguación.
En el otro extremo de las escalas espaciales, el campo de visión máximo de la TPLSM cubre volúmenes cada vez más grandes. Esta expansión está impulsada por objetivos especiales de alta apertura numérica (NA) con baja magnificación y nuevas técnicas de marcaje para medir patrones de actividad en redes celulares distribuidas. En la actualidad, el tamaño lateral de los campos de visión típicos es del orden de unos pocos cientos de micrones, pero puede alcanzar un milímetro pronto. Para el futuro, un desafío importante es cubrir áreas o volúmenes 3D aún más grandes manteniendo la resolución celular y una resolución temporal suficiente. Es muy probable que tales desarrollos requieran nuevas tecnologías.
Limitaciones de Profundidad de Penetración
A pesar de la sensibilidad sustancialmente reducida de la TPLSM a la dispersión de la luz, los estudios de imagenología de dos fotones todavía están limitados en términos de Penetración Profunda. La profundidad máxima de imagenología que se ha alcanzado en el neocórtex es de aproximadamente 1 mm. La fluorescencia de fondo generada durante la imagenología profunda establece un límite fundamental a la profundidad alcanzable. Por lo tanto, la TPLSM está restringida a áreas cercanas a la superficie del cerebro.
Hasta ahora, se ha aplicado principalmente a áreas cerebrales fácilmente accesibles como el neocórtex, el cerebelo, el bulbo olfatorio y, más recientemente, el cuerno dorsal de la médula espinal. Se requieren procedimientos especiales para alcanzar regiones cerebrales más profundas como el hipocampo. Particularmente prometedoras son las lentes en forma de varilla (conocidas como lentes de índice de gradiente o GRIN), que tienen diámetros inferiores a un milímetro y pueden dirigirse a áreas más profundas para imagenología endoscópica. Por ejemplo, utilizando este enfoque, se han visualizado células piramidales teñidas fluorescentemente en el hipocampo de ratones vivos.
Principios Teóricos de la Absorción de Dos Fotones
La absorción de dos fotones (TPA) es un proceso óptico no lineal. En términos simples, en la TPA no resonante, ninguno de los fotones individuales está en resonancia con la brecha de energía del sistema. Sin embargo, dos fotones se combinan para salvar una brecha de energía mayor que la energía de cada fotón individualmente. Esto puede visualizarse como si ocurriera a través de un 'estado virtual' creado por la interacción de los fotones con la molécula. La naturaleza 'no lineal' significa que la fuerza de la interacción aumenta más rápido que linealmente con el campo eléctrico de la luz. De hecho, en condiciones ideales, la tasa de absorción de dos fotones es proporcional al cuadrado de la intensidad del campo. Esta dependencia requiere altas intensidades de luz, por lo que se necesitan láseres, típicamente pulsados y sintonizables, para estudiar los fenómenos de TPA.
Las reglas de selección para la absorción de dos fotones son diferentes de las de la absorción de un fotón. En una molécula centrosimétrica, las transiciones permitidas para un fotón y dos fotones son mutuamente excluyentes. Sin embargo, para las moléculas no centrosimétricas, no hay una exclusión mutua formal. En términos cuánticos, esto se relaciona con la simetría de inversión de los estados cuánticos (etiquetados como g y u). Las transiciones de un fotón solo se permiten entre estados que difieren en simetría de inversión (g <-> u), mientras que las transiciones de dos fotones solo se permiten entre estados que tienen la misma simetría de inversión (g <-> g y u <-> u).
Medición y Coeficientes
La absorción de dos fotones se puede medir mediante varias técnicas, incluyendo la fluorescencia excitada por dos fotones (TPEF), z-scan, autodifracción o transmisión no lineal. Como se mencionó, se utilizan principalmente láseres pulsados debido a la dependencia de la intensidad.
Mientras que la ley de Beer describe la disminución de intensidad debido a la absorción de un fotón (decaimiento exponencial), en la absorción de dos fotones, la intensidad de la luz en función de la distancia cambia de una manera diferente, involucrando un coeficiente de TPA, a menudo denotado como β. La sección transversal de absorción de dos fotones molecular se suele citar en unidades de Goeppert-Mayer (GM), donde 1 GM = 10^-50 cm^4 s fotón^-1. Este factor de escala grande se introduce para que las secciones transversales de 2 fotones de los tintes comunes tengan valores convenientes.
Absorción de Dos Fotones en Agua
La absorción de dos fotones inducida por láser en agua fue descubierta en 1980. El agua absorbe radiación UV cerca de 125 nm, lo que lleva a la disociación en OH- y H+. A través de la absorción de dos fotones, esta disociación se puede lograr con dos fotones cerca de 266 nm. Dado que el agua (H2O) y el agua pesada (D2O) tienen diferentes frecuencias de vibración e inercia, también necesitan diferentes energías fotónicas para lograr la disociación y tienen diferentes coeficientes de absorción para una longitud de onda fotónica dada.
| Longitud de onda (nm) | Duración del pulso (ps) | β × 1011 (cm/W) |
|---|---|---|
| 315 | 29 | 4 |
| 300 | 29 | 4.5 |
| 289 | 29 | 6 |
| 282 | 29 | 7 |
| 282 | 0.18 | 19 |
| 266 | 29 | 10 |
| 264 | 0.22 | 49±5 (H2O) |
| 216 | 15 | 20 |
| 213 | 26 | 32 |
| - | 0.22 | 42±5 (D2O) |
Nota: Los datos de D2O corresponden a una longitud de onda cercana a 264 nm.
Desarrollo y Compuestos Fluorescentes
Hasta cierto punto, las fuerzas de absorción lineal y de 2 fotones están vinculadas. Por lo tanto, los primeros compuestos estudiados (y muchos que todavía se estudian y utilizan en microscopía de 2 fotones) fueron tintes estándar, particularmente tintes láser debido a su buena fotoestabilidad. Sin embargo, estos tintes tienden a tener secciones transversales de 2 fotones del orden de 0.1 a 10 GM, mucho menos de lo necesario para experimentos simples.
No fue hasta la década de 1990 que comenzaron a desarrollarse principios de diseño racional para la construcción de moléculas que absorbieran dos fotones de manera eficiente, en respuesta a la necesidad de tecnologías de imagen y almacenamiento de datos, y ayudados por el rápido aumento en la capacidad computacional que permitió realizar cálculos cuánticos. Se encontró que las características más importantes de las moléculas que absorben fuertemente dos fotones son un largo sistema de conjugación y la sustitución por grupos donadores y aceptores fuertes. Por lo tanto, muchos olefinas push-pull exhiben altas transiciones de TPA, hasta varios miles de GM. También se encuentra que los compuestos con un nivel de energía intermedio real cercano al nivel de energía 'virtual' pueden tener grandes secciones transversales de 2 fotones como resultado de la mejora por resonancia.
Emisión de Dos Fotones
El proceso opuesto a la absorción de dos fotones es la emisión de dos fotones (TPE), que es una transición de un solo electrón acompañada por la emisión de un par de fotones. La energía de cada fotón individual del par no está determinada, mientras que el par en su conjunto conserva la energía de la transición. Por lo tanto, el espectro de emisión de dos fotones es muy amplio y continuo. La emisión de dos fotones es importante para aplicaciones en astrofísica, contribuyendo a la radiación continua de las nebulosas planetarias. La emisión de dos fotones en materia condensada y específicamente en semiconductores solo se observó por primera vez en 2008, con tasas de emisión casi 5 órdenes de magnitud más débiles que la emisión espontánea de un fotón, con posibles aplicaciones en información cuántica.
Preguntas Frecuentes sobre Microscopía de Dos Fotones en Neurociencia
¿Qué es la microscopía de dos fotones?
Es una técnica de microscopía de fluorescencia que utiliza la absorción simultánea de dos fotones de baja energía (típicamente en el infrarrojo cercano) para excitar una molécula fluorescente. Esto contrasta con la microscopía convencional que usa un solo fotón de mayor energía.
¿En qué se diferencia de la microscopía confocal?
La principal diferencia radica en el proceso de excitación y la longitud de onda utilizada. La microscopía de dos fotones usa luz infrarroja cercana (mayor longitud de onda), que penetra más en los tejidos y se dispersa menos. Además, la excitación no lineal confina la fluorescencia al foco, eliminando la necesidad de un pinhole y mejorando la imagen en profundidad.
¿Por qué es útil la microscopía de dos fotones para estudiar el cerebro?
Permite obtener imágenes de alta resolución y sensibilidad en tejido neural intacto y vivo, que es opaco para otras técnicas. Sus ventajas de penetración profunda y menor dispersión permiten visualizar estructuras y procesos dinámicos (cambios morfológicos, actividad celular, flujo sanguíneo) a nivel celular y subcelular dentro del cerebro, abriendo una ventana a su funcionamiento en tiempo real.
¿Qué se puede visualizar con esta técnica en el cerebro?
Se pueden visualizar neuronas individuales, sinapsis (espinas dendríticas, botones axónicos), células gliales (como la microglía), vasos sanguíneos y la dinámica de marcadores funcionales como indicadores de calcio para medir la actividad neuronal.
¿Cuáles son las limitaciones de la microscopía de dos fotones?
La principal limitación es la profundidad de penetración, que actualmente está limitada a aproximadamente 1 mm en el neocórtex debido a la fluorescencia de fondo. Se requieren técnicas especiales, como las lentes GRIN para imagenología endoscópica, para alcanzar regiones más profundas.
¿Necesito marcar las células para usar microscopía de dos fotones?
Sí, se requiere un marcaje fluorescente de las estructuras o procesos de interés. Idealmente, se busca un marcaje disperso y de alto contraste para poder distinguir células individuales.
En conclusión, la TPLSM es una técnica versátil para obtener imágenes tanto de la dinámica estructural como de la función celular en el cerebro vivo. A pesar de sus limitaciones de profundidad, ha revolucionado la neurociencia al permitir la observación de procesos complejos en su entorno natural, proporcionando información invaluable sobre cómo funciona el sistema nervioso a diferentes escalas.
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