¿Cómo Trazamos las Conexiones del Cerebro?

El cerebro humano, una red intrincada de miles de millones de neuronas, depende de conexiones precisas para funcionar. Comprender cómo estas células se comunican, dónde envían sus señales y de dónde las reciben es fundamental para desentrañar los misterios de la cognición, el comportamiento y las enfermedades neurológicas. Aquí es donde entra en juego el trazado de tractos neuronales, una poderosa herramienta que permite a los científicos visualizar y mapear estas complejas autopistas de información.

El trazado anatómico de tractos implica introducir sustancias especiales en el tejido nervioso que son captadas por las neuronas y transportadas a lo largo de sus axones. Estas sustancias actúan como 'rastreadores', dejando una marca que puede ser detectada posteriormente para seguir el camino de la conexión. Aunque la variedad de compuestos disponibles hoy en día permite enfoques muy creativos, los métodos clásicos establecen una secuencia de pasos que forman la columna vertebral de un experimento típico de trazado.

El Procedimiento Básico del Trazado de Tractos

Un experimento de trazado clásico generalmente sigue varias etapas clave, diseñadas para introducir el rastreador, permitir su movimiento dentro de las neuronas y, finalmente, visualizar su ubicación en el tejido.

1. Administración del Rastreador

El primer paso es introducir la sustancia rastreadora en una ubicación específica del sistema nervioso. Esto se hace típicamente mediante inyección, utilizando dispositivos de administración controlada para maximizar la precisión y controlar el volumen. En primates no humanos, a menudo se utilizan microsiringas Hamilton, montadas en unidades de microinyección y micromanipuladores. Estos permiten inyectar volúmenes muy pequeños (0.1 μl–1.0 μl) de forma controlada. El tamaño y la dispersión de la inyección dependen de factores como el diámetro de la aguja, la velocidad de inyección, la composición del tejido y la concentración del rastreador.

Otro método común emplea micropipetas de vidrio, cuyo tamaño y forma se pueden ajustar con precisión. La inyección desde micropipetas puede realizarse mediante iontoforesis (usando corriente eléctrica), presión de aire (picobombas neumáticas) o sistemas hidráulicos. Una técnica más reciente es la inyección peri- o juxtacelular, que deposita un volumen diminuto de rastreador en el espacio extracelular justo al lado del cuerpo celular de una neurona, a menudo mientras se registra su actividad electrofisiológica. Este enfoque permite etiquetar células individuales o pequeños grupos, mostrando detalles finos de la neurona, incluyendo el axón completo y sus terminales, de manera similar a la tinción de Golgi.

2. Periodo de Supervivencia Post-Inyección

Después de la inyección, se requiere un tiempo de supervivencia adecuado para que el rastreador sea captado por las neuronas y transportado a lo largo de sus axones (transporte axoplasmático). La duración óptima varía según el rastreador y el sistema de proyección estudiado. Algunos rastreadores utilizan el sistema de transporte rápido, lo que implica periodos de supervivencia cortos. La peroxidasa de rábano (HRP) es un ejemplo clásico que se transporta rápidamente en ambas direcciones (anterógrada y retrógrada), con resultados óptimos generalmente entre 2 y 5 días.

Otros, como los aminoácidos tritiados, se incorporan a proteínas citoplasmáticas y dependen del transporte axónico lento, requiriendo periodos de supervivencia más largos, de 7 a 21 días en primates para proyecciones extensas. Las dextranaminas pueden requerir periodos aún mayores, hasta 7 semanas en primates, dependiendo de la longitud de la vía.

3. Fijación y Corte de Tejido

El objetivo principal de esta etapa es preservar el tejido nervioso y maximizar la visibilidad del rastreador, minimizando los artefactos. El proceso comienza con la anestesia profunda del animal y la perfusión con una solución salina para eliminar la sangre del sistema circulatorio, seguida de una solución fijadora, típicamente un aldehído tamponado como formaldehído o glutaraldehído. La fijación estabiliza el rastreador en su ubicación intracelular y limita su difusión durante el procesamiento posterior.

El fijador elegido depende del rastreador y de cualquier procedimiento adicional, como métodos de doble o triple marcaje (por ejemplo, para visualizar neurotransmisores o receptores asociados, a menudo usando inmunohistoquímica). Si se planea un examen con microscopía electrónica para ver contactos sinápticos, esto también influye en la elección del fijador. A veces, se infunde un crioprotector (como sacarosa) después del fijador para evitar la formación de cristales de hielo si el tejido se congela para almacenamiento o corte. El tejido fijado y crioprotegido se congela y se corta en secciones finas usando un micrótomo. Alternativamente, si no se usa crioprotección (por ejemplo, para llenado intracelular post-mortem o visualización de contactos sinápticos), el tejido se corta en húmedo con un vibrátomo.

Es crucial mantener las secciones en orden serial para permitir la reconstrucción tridimensional o bidimensional de las vías etiquetadas, ya sea con software especializado o mediante dibujos de secciones seriales, como se hacía clásicamente.

4. Detección del Rastreador Transportado

Algunos rastreadores, como los compuestos fluorescentes intrínsecos o las microesferas fluorescentes, son directamente visibles al microscopio de fluorescencia después del corte y montaje de las secciones. Sin embargo, muchos rastreadores son invisibles en este punto y requieren procesamiento adicional para generar un producto visible.

Esto puede lograrse mediante procesamiento histoquímico (como para la HRP, que utiliza un cromógeno como la diaminobencidina, DAB) o autorradiografía (para rastreadores radiomarcados, como los aminoácidos tritiados). Un método más común y versátil es la inmunohistoquímica, que utiliza anticuerpos para detectar el rastreador. Esta técnica permite una amplificación considerable de la señal, lo que lleva a una localización muy precisa del producto etiquetado. La detección óptica final en histoquímica e inmunohistoquímica a menudo implica la formación de un precipitado denso e insoluble sobre el compuesto transportado, mediante una reacción enzimática con un cromógeno (agente colorante). Dependiendo del método y el cromógeno (DAB, TMB, etc.), el precipitado puede ser marrón, negro, azul, púrpura o verde. A menudo se utiliza la mejora con níquel para obtener un producto negro o azul-negro que mejora el contraste.

Técnicas de Trazado Neuroanatómico Basadas en el Transporte Neuronal

La base de muchas técnicas de trazado es la capacidad de las neuronas vivas para captar y transportar macromoléculas. Este transporte ocurre de dos maneras principales:

• Transporte Retrógrado: Desde los terminales axónicos o dendritas distales hacia el cuerpo celular (pericarion).
• Transporte Anterógrado: Desde el cuerpo celular y las dendritas a lo largo del axón hacia los terminales.

Aunque la mayoría de los rastreadores muestran cierto grado de transporte bidireccional, uno de los sentidos suele predominar. Esta distinción es fundamental para elegir la técnica adecuada según la dirección de la conexión que se desea estudiar.

Trazadores Anterógrados Clave

Dextranamina Biotinilada (BDA)

Introducida a principios de los 90, la BDA, especialmente la de 10 kDa, se ha convertido en el rastreador anterógrado de elección. Se cree que es captada por dendritas y cuerpos celulares mediante un mecanismo desconocido y transportada predominantemente en dirección anterógrada. La BDA 'llena' el citoplasma neuronal, produciendo un etiquetado homogéneo que muestra detalles finos como las espinas dendríticas y la trayectoria completa del axón hasta sus terminales. Esto permite mapear con precisión las vías, analizar la compartimentación de fascículos y estudiar patrones de proyección terminal. La detección se realiza comúnmente mediante estreptavidina conjugada con HRP (para un producto de reacción visible, como DAB) o con fluorocromos (para visualización fluorescente). La BDA es compatible con una amplia gama de fijadores y procedimientos de inmunohistoquímica, lo que la hace muy versátil.

Aunque es principalmente anterógrada, la BDA puede mostrar transporte retrógrado, a veces etiquetando cuerpos celulares. Esto puede ser una limitación o, en algunos casos, una ventaja para estudiar conexiones recíprocas.

Phaseolus vulgaris-leucoagglutinin (PHA-L)

Esta lectina, obtenida del frijol común, es captada casi exclusivamente por los cuerpos celulares y transportada en dirección anterógrada hacia los terminales axónicos. Se cree que la captación es mediada por receptores. La detección se realiza mediante un anticuerpo contra la lectina, seguido de un método inmunohistoquímico. Al igual que la BDA, la PHA-L revela detalles exquisitos de la neurona, incluyendo las ramas terminales del axón y los botones terminales. Su detección inmunohistoquímica la hace ideal para combinaciones con otros métodos de trazado o inmunomarcaje.

Neurobiotina y Biocitina

Estos derivados de la biotina se introdujeron inicialmente para marcar neuronas registradas intracelularmente. Sin embargo, tras la inyección extracelular, también son captados y transportados, principalmente de forma anterógrada, aunque con tendencia a transporte retrógrado con inyecciones grandes. Son útiles para el trazado de corta distancia y para la visualización de neuronas individuales o pequeños grupos mediante inyección juxtacelular. Se metabolizan rápidamente, por lo que requieren periodos de supervivencia cortos (1-4 días). Son compatibles con microscopía electrónica y procedimientos combinados.

Aminoácidos Tritiados

Históricamente importantes, estos aminoácidos radiactivos (como 3H leucina o 3H prolina) son captados por los cuerpos celulares, incorporados a proteínas y transportados estrictamente de forma anterógrada (ya que los axones no tienen ribosomas). La detección se realiza mediante autorradiografía, donde las partículas beta emitidas por el isótopo exponen una emulsión fotográfica sobre la sección. Aunque fue revolucionaria, esta técnica es laboriosa, lenta, tiene menor resolución que los métodos modernos y requiere manejo de material radiactivo, por lo que ha sido ampliamente reemplazada por rastreadores macromoleculares.

Compuestos de Cobalto y Níquel

Estos iones metálicos pesados pueden usarse para llenar neuronas, a menudo mediante inyección intracelular. También pueden ser transportados en el sistema nervioso, aunque su uso es menos común hoy en día, limitándose principalmente a especies de sangre fría e invertebrados. Se visualizan mediante reacciones que precipitan el metal.

Trazadores Retrógrados Clave

Peroxidasa de Rábano (HRP)

La HRP fue uno de los primeros rastreadores enzimáticos utilizados para el trazado retrógrado. Es captada por los terminales nerviosos (y también por fibras de paso dañadas) mediante endocitosis fluida y transportada retrógradamente en endosomas hacia el pericarion. La detección se basa en su actividad enzimática, que cataliza la formación de un precipitado visible (típicamente marrón con DAB). Aunque fue pionera, la HRP nativa ha sido superada en sensibilidad por rastreadores más modernos y conjugados.

Compuestos Fluorescentes Inorgánicos

Estos colorantes (como Fast Blue - FB, Diamidino Yellow - DY, Fluoro-Gold - FG) son captados por los terminales nerviosos y transportados retrógradamente a los cuerpos celulares, donde se acumulan. La gran ventaja es que son directamente visibles bajo un microscopio de fluorescencia sin necesidad de procesamiento histoquímico complejo. Son fiables para trazar vías largas y son excelentes para experimentos de doble marcaje (para estudiar colateralización axónica) o combinados con inmunofluorescencia para identificar la identidad neuroquímica de las neuronas etiquetadas. FB y DY etiquetan diferentes compartimentos celulares (citoplasma y núcleo, respectivamente), facilitando la distinción en doble marcaje. FG es muy resistente a la decoloración y persiste por largos periodos, convirtiéndose en un estándar para el etiquetado fluorescente retrógrado, especialmente en roedores.

Toxinas Bacterianas (Familia CTB)

Conjugados de la toxina del cólera (CTB), como CTB-HRP, se desarrollaron buscando mayor sensibilidad que la HRP nativa. La captación de CTB es mediada por receptores (endocitosis adsorbente), lo que la hace más eficiente y menos propensa a ser captada por fibras de paso indemnes que la HRP. CTB-HRP se transporta bidireccionalmente y es menos metabolizada que la HRP. El uso de CTB no conjugada con detección inmunohistoquímica (con anticuerpos anti-CTB) se ha vuelto común, eliminando el fondo asociado a las peroxidasas endógenas. Existen conjugados de CTB con fluorocromos (como Alexa Fluor™) que son directamente visibles y muy fotoestables, ideales para microscopía confocal.

Micro y Nanopartículas

Partículas inertes recubiertas con etiquetas (como microesferas de látex fluorescentes o nanopartículas de oro) también se utilizan para trazado retrógrado. Son captadas por los terminales nerviosos y transportadas al cuerpo celular. Una ventaja es su visibilidad potencial tanto en microscopía óptica como electrónica. Las microesferas fluorescentes pueden ser captadas por fibras de paso dañadas. Las nanopartículas, como las de oro recubiertas con WGA-apoHRP, son captadas y transportadas retrógradamente, siendo visibles directamente en microscopía electrónica o mediante mejora con plata para microscopía óptica. Su compatibilidad con otras técnicas las hace versátiles.

Trazado Bidireccional y Multimarcaje

Aunque algunos rastreadores (como WGA-HRP o CTB) muestran transporte significativo en ambas direcciones, el trazado bidireccional a menudo se logra indirectamente mediante la aplicación simultánea de un rastreador anterógrado y un rastreador retrógrado diferentes. Esto permite estudiar las conexiones de ida y vuelta entre dos regiones.

Los experimentos de multimarcaje llevan esto más allá, utilizando múltiples rastreadores (dos o más anterógrados, dos o más retrógrados, o combinaciones) en el mismo animal para estudiar la convergencia o divergencia de proyecciones, o la identidad neuroquímica de las neuronas proyectantes. Combinaciones comunes incluyen BDA y PHA-L (ambos anterógrados, detectados por separado) o combinaciones de rastreadores fluorescentes retrógrados como FG, FB y CTB. El procesamiento para visualizar múltiples rastreadores en la misma sección puede ser complejo, a menudo requiriendo el uso de diferentes cromógenos (para microscopía de campo claro) o fluorocromos con espectros de emisión distintos (para microscopía de fluorescencia o confocal). A pesar de la complejidad, el multimarcaje es invaluable para obtener una imagen completa de la conectividad y la organización neuronal en sistemas complejos.

Comparativa de Trazadores Comunes

Preguntas Frecuentes sobre el Trazado Neuronal

¿Por qué se necesitan diferentes tipos de rastreadores?

Se necesitan diferentes rastreadores porque las vías neuronales pueden estudiarse en distintas direcciones (anterógrada o retrógrada), los rastreadores tienen diferentes mecanismos de captación y transporte, varían en sensibilidad, persisten por diferentes periodos de tiempo, y tienen distinta compatibilidad con otras técnicas (como la inmunohistoquímica o la microscopía electrónica). La elección depende de la pregunta científica específica, la especie animal, la longitud de la vía y si se planea combinar el trazado con otras técnicas.

¿Cuánto tiempo dura un experimento de trazado?

El tiempo total varía, pero el periodo crítico de supervivencia post-inyección puede ir desde un par de días (para rastreadores de transporte rápido como HRP) hasta varias semanas o incluso meses (para rastreadores de transporte lento o aquellos que persisten mucho tiempo como FG) dependiendo del rastreador y la distancia de la proyección a trazar.

¿Se puede ver una sola neurona con estas técnicas?

Sí, algunas técnicas, como la inyección intracelular o juxtacelular de rastreadores como Neurobiotina/Biocitina o BDA en volúmenes muy pequeños, permiten etiquetar y visualizar la morfología completa de neuronas individuales, incluyendo sus dendritas y axones.

¿Es posible combinar el trazado con otras técnicas, como la identificación de neurotransmisores?

Absolutamente. Una de las mayores ventajas de muchos rastreadores modernos (especialmente aquellos detectados inmunohistoquímicamente o los fluorescentes compatibles con inmunofluorescencia) es su capacidad para combinarse con técnicas de inmunomarcaje para detectar neurotransmisores, receptores, proteínas específicas o interneuronas dentro de las regiones de interés. Esto permite determinar la identidad neuroquímica de las neuronas proyectantes o de sus células objetivo.

En resumen, el trazado de tractos neuronales es un conjunto de técnicas versátiles y poderosas que continúan siendo indispensables para mapear la arquitectura del cerebro. Desde los métodos históricos hasta las aproximaciones de multimarcaje de vanguardia, estas herramientas nos permiten desentrañar la increíble complejidad de las conexiones neuronales, un paso fundamental para comprender cómo funciona el cerebro y qué sale mal en la enfermedad.

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